2.1 Cardiopathies et Mutations du gène PTPN11 chez les patient(e)s porteurs du syndrome de Noonan
Le premier travail de recherche entre dans le cadre d‟un PHRC (Projet
Hospitalier de Recherche Clinique). Il a inclus l‟étude des données phénotypiques et la réalisation du séquençage du gène PTPN11 chez les patients porteurs du syndrome de Noonan. Ce projet élaboré et coordonné sous la tutelle du Professeur Alain Verloes - Unité Fonctionnelle de génétique à l‟Hôpital Robert Debré (Paris France) - a été initié au printemps 2002 et conduit durant 5 ans. Ila été déposé sous l‟intitulé : « Étude des manifestations cardiaques dans une large cohorte de patients porteurs du syndrome de Noonan et interprétations du rôle et des fonctions possibles du gène PTPN11 »
Nous avons intégré la compréhension de la survenue de mutation du gène
PTPN11 à l‟origine des cardiopathies et ce, en catégorisant les cardiopathies par nature et en localisant la mutation identifiée dans les domaines fonctionnels de la protéine.
Matériel et Méthodes
La méthodologie repose sur l‟utilisation de critères d‟une étude rétrospective multicentrique car le premier prérequis est de rassembler les données phénotypiques, anthropomorphiques, anatomiques d‟une cohorte précisément définie de patient(e)s porteur(se)s du syndrome de Noonan. Le choix du caractère rétrospectif s‟impose puisque nous ne disposions de cohortes validées de patients à partir desquelles il aurait été aisé de séquencer le gène
PTPN11 et de réaliser les études de corrélations génotype/phénotype. Les validités du diagnostic et des descriptions obtenues reposent sur le fait que les patients sont évalués par des généticiens cliniciens. Les généticiens issus de centre différents, bénéficiant d‟une formation analogue n‟ont pas reçu un enseignement homogène, similaire et continu permettant de standardiser et de contrôler les paramètres retenus pour poser le diagnostic phénotypique (indépendamment des modifications naturelles au fil du temps qui sont associées au syndrome de Noonan (Sharland 1993). Le score de Duncan n‟est pas utilisé en génétique clinique du fait des limitations déjà décrites. Le score de Van der Burgt a servi de base au centre de référence pour inclure ou non les patients référés et intier les études de biologie moléculaire (séquençage du gène). La diversité des âges des patients et leur variabilité phénotypique demeure une source d‟imprécision. Pour limiter ces variations, une liste de 72 paramètres a été établie et constitue le livret d‟observation clinique répertoriant des données quantitatives (paramètres néonataux) aussi bien que qualitatives (difficultés alimentaires, hypotonie,…). Des photographies des patients à différents âges étaient requises et intégrées à l‟évaluation clinique. Une faiblesse de cet outil méthodologique est le fait que des données non collectées a priori peuvent manquer de manière définitive. Les médecins généticiens cliniciens de France, de Belgique et de Suisse ont référé leurs patients porteurs du phénotype du syndrome de Noonan afin que soient
répertoriés toutes les données phénotypiques (Livret clinique - Étude Noonan ; Annexe I).
Les généticiens ont alors reçu le livret clinique qui devait être complété. Les photographies des patients devaient être fournies. Après un mois, en l‟absence des données cliniques et/ou des photographies, les généticiens référant étaient reconvoqué et, selon les situations, soit il leur était demandé de compléter les données manquantes soit le livret complété copié était notifié pour les quelques données faisant défaut. Après trois mois, lors de la réunion des généticiens de France (Assises de Génétique – Montpellier 2002) une première présentation des données a été faite et une nouvelle distribution à chaque généticien du livret adapté à chacun de leur patient (selon les données à compléter) était réalisée. Un dernier rappel et une dernière collecte des données cliniques ont été pratiqués à six mois.
Les données d‟échographie cardiaque sont quantitatives, donc reproductibles et ne tombant pas sous le biais de différences inter-observateurs. Ceci est vrai si les praticiens ont reçu la même formation, utilisent le même appareil et réalisent les mesures de la même manière. Les cardiopathies sont classées selon les définitions de référence des cardiopathies établies par Van Praagh et al. Au fil des années, les capacités d‟investigation par échographie se sont perfectionnées mais la méthodologie et les mesures doppler et de repérage anatomique demeurent inchangé. Une précision : la classification des cardiopathies distingue, pour la valve pulmonaire, une dysplasie ou une sténose ou alors la valve est normale. Du fait du caractère rétrospectif de la collecte des données, il n‟a pas été possible d‟obtenir précisément la description du caractère dysplasique ou sténotique de cette valve. Nous avons repris sous le terme commun « sténose valvulaire pulmonaire », la présence d‟une dysplasie ou d‟une sténose. Les patients sont inclus si le livret d‟évaluation clinique est complet ; si les parents (pour les patients mineurs) et
dans l‟application de travaux sur la personne humaine - Loi Huret (France) - ont complété et signé le consentement éclairé.
Séquençage du gène PTPN11
À partir de l‟ADN génomique extrait des patients, l‟étude inclut le séquençage du gène PTPN11, seul gène identifié en 2002 comme responsable du syndrome de Noonan. Le prélèvement d‟ADN est adressé au laboratoire de biologie moléculaire à l‟Hôpital Robert Debré sous la supervision du Dr Hélène Cavé. Le séquençage bi-directionnel du gène PTPN11 est centré sur les exons 2, 3, 4, 7, 8, 12, 13 ainsi que les jonctions „intron-exon‟, couvrant ainsi 98% des mutations retrouvées chez les patients au syndrome de Noonan. Ce séquençage est réalisé grâce au séquenceur ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La détection de la présence d‟une mutation est réalisée en utilisant ABI PRISM SeqScape (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) par comparaison des séquences de référence (GenBank Accession Number NT_009775.14 et NM_002834).
Statistiques
Cette étude rétrospective a impliqué la création d‟un fichier „Access‟ : conception, élaboration, validation ont été effectuées avec l‟assistance de Madame Corinne Alberti du département d‟épidémiologie et d‟études cliniques à l‟Hôpital Robert Debré. Chaque livret clinique a été encodé pour chaque patient dans ce fichier „Access‟ « Etude Noonan » par deux investigateurs en parallèle pour limiter les erreurs d‟entrée des données. Pour les paramètres de variables quantitatives et de comparaison, le test du χ2 et le test exact de Fisher sont utilisés. Le seuil de signification statistique est défini pour une valeur de p<0.05.
Cette étude constitue le premier volet investiguant les caractéristiques anatomiques cardiaques et est conduite afin de constituer une étude indépendante pour apprécier le rôle du gène PTPN11 dans l‟apparition de malformations cardiaques chez les patients porteurs de ce syndrome : l‟incidence de chaque cardiopathie retrouvée chez les patients porteurs du syndrome de Noonan est comparée aux données de répartitions à partir des études épidémiologiques disponibles pour les cardiopathies dans la population générale (Eurocat ; Bosi 1999 ; Stephensen 2004).
Résultats
272 patients sont diagnostiqués comme porteurs du syndrome de Noonan et inclus. Parmi ces 272 patients, on note la présence de 149 garçons et 123 filles. L‟âge moyen est de 7 ans (quartile inférieur : 2 ans - quartile supérieur : 13 ans).
104 patients de cette cohorte sont identifiés porteurs d‟une mutation du gène
PTPN11 soit un taux de mutation de 38,25%. Toutes les mutations identifiées sont des mutations exoniques faux-sens à l‟exception d‟une qui est une délétion de 3 paires de bases (cf. ci-dessous). Les mutations sont retrouvées de manière prévalentes au sein des exons codant pour les domaines SH2 et PTP ou les segments reliant les trois domaines.La mutation prévalente c.922A>G (p.N308D) est retrouvée chez 18.25% des patients (Tableau 2). Parmi les patients identifiés porteurs d‟une mutation au sein du gène PTPN11, 85% sont diagnostiqués porteurs d‟une cardiopathie.
Dans notre étude multicentrique, nous avons analysé la répartition des cardiopathies pour les patients pour lesquels une mutation du gène PTPN11 a été identifiée comparativement aux patients phénotypiquement non distinguables mais pour lesquels une mutation n‟a pu être identifiée (Tableau 1).
Analyse des cardiopathies :
Patients porteurs d’une mutation versus patients non porteurs
Entre les deux groupes de patients :
- l‟incidence de survenue d‟une sténose valvulaire pulmonaire est de 59.6% dans le groupe avec mutation comparée à 31.5% pour le groupe sans mutation.
- l‟incidence de survenue d‟une CIA de type ostium secundum de 25% versus
13%, respectivement.
- l‟incidence de survenue de sténoses des artères pulmonaires périphériques de 15.4% versus 10.1%, respectivement.
- la survenue de cardiopathies entreprenant le cœur gauche est corrélée avec l‟absence d‟identification de mutation au sein du gène PTPN11 (différence statistiquement significative).
Précisément :
- le diagnostic d‟insuffisance mitrale est retrouvé dans 4.8% dans le groupe avec mutation pour une incidence de 7.1% dans le groupe sans mutation ;
- le diagnostic de sténose aortique est de 1.9% versus 4.7%, respectivement ;
- le diagnostic de coarctation de l‟aorte dans 0.96% versus 5.95% ;
- le diagnostic de communication inter-ventriculaire de 6.75% versus
13.7%, respectivement.
- Lorsque l‟on répertorie, dans notre cohorte, le site de survenue des mutations, on retrouve les données suivantes :
o dans 44% des cas au sein du domaine N-SH2 ; o dans 4.8% au sein du domaine C-SH2 ;
o dans 2.9% au sein de la région de jonction N-SH2/C-SH2 ; o et 50% au sein du domaine PTP
La répartition par exon des mutations identifiées s‟établit comme suit : exon 2 : <1% ; exon 3 : ~=50% ; exons 4 : 4.8% ; exon 7 : 5.8% ; exon 8 : 26% et exon 13 : 18.30% - (Tableau 2)
L‟analyse du risque relatif (RR) de survenue d‟une cardiopathie spécifique est colligée dans le Tableau 4 : leur survenue associée au syndrome de Noonan est
périphérique des artères pulmonaires (RR : 23.30) ; le canal atrio-ventriculaire (RR : 5.37) ; la sténose de la valve aortique (RR : 16.00) et l‟insuffisance mitrale (RR : 35.60).
Le spectre des anomalies cardiaques observées chez les patients porteurs d‟une mutation du gène PTPN11 souligne une prédominance dans l‟atteinte des structures droites du cœur.
Discussion
Depuis l‟intégration des données historiques, six études de corrélation ont été publiées dans la littérature après mise en évidence de mutations du gène
PTPN11 (Tableau 3).
Tartaglia et al. publient la première étude de corrélation phénotype/génotype mais la méthodologie choisie ne répertorie que les cardiopathies suivantes: sténose valvulaire pulmonaire, communication inter-auriculaire type ostium secundum et cardiomyopathie hypertrophique. Cette étude est composée de 141 patients dont 81 présentent une forme familiale et 60 ont une forme sporadique. La petite taille des autres familles n‟autorise pas la conduite d‟études de liaison. En terme individuel, le taux de détection de mutation est de 45%. L‟incidence, lorsqu‟il s‟agit d‟une forme familiale, atteint 59% et est de 37% lorsqu‟il s‟agit d‟une forme sporadique.Le taux de mutation associé à la présence d‟une sténose de la valve pulmonaire est de 70.6% ; alors que la cardiopathie est retrouvée chez 46.2% des patients sans qu‟une mutation ne soit retrouvée dans le gène PTPN11 (p<0.01). Enfin, la présence d‟une cardiomyopathie est associée à une prévalence accrue de ne pas trouver de mutation au sein du gène (26% versus 5.9%, respectivement ; p<0.01). Les autres cardiopathies diagnostiquées éventuellement ne sont pas détaillées et aucune description des cardiopathies n‟est faite dans le groupe de patients pour lesquels une mutation n‟a pu être identifiée (Tartaglia 2002).
Musante et al. rapportent les résultats de l‟étude d‟une cohorte de 96 patients porteurs du syndrome de Noonan. Le taux de détection de mutation est de 29%, la cardiopathie prévalente retrouvée est la sténose valvulaire pulmonaire (60%) ; aucune description n‟est faite des patients sans mutation identifiée, et seul le descriptif est effectué pour les deux cardiopathies suivantes : la sténose pulmonaire et cardiomyopathie. Cette étude confirme les résultats de l‟étude originale de Tartaglia (Musante 2003).
Sarkozy et al. décrivent 73 patients (incluant des patients au syndrome de Noonan et au syndrome LEOPARD) et le taux de détection de mutation du gène PTPN11 est de 37%. Les cardiopathies associées à la présence d‟une mutation sont : sténose valvulaire pulmonaire, cardiomyopathie hypertrophique, canal atrio ventriculaire partiel et communication inter-auriculaire de type ostium secundum. Aucun patient n‟est diagnostiqué porteur d‟une coarctation de l‟aorte, d‟une tétralogie de Fallot ou d‟une communication inter-ventriculaire. Une mutation au sein de l‟exon est prévalente chez les patients porteurs d‟une mutation dans l‟exon 3 sans toutefois atteindre la signification statistique. 70% des mutations surviennent dans le domaine PTP ; toutes les mutations affectant le domaine SH-2 s‟accompagnent de la mise en évidence d‟une cardiopathie (Sarkozy 2003). Zenker et al. rapportent les observations d‟une cohorte de 57 patients pour lesquels le taux de détection de mutation est de 60%. La présence de sténose valvulaire pulmonaire est retrouvée chez 88% des patients ayant été identifié porteur d‟une mutation. 3% de ceux-ci développent une cardiomyopathie hypertrophique. Aucune description n‟est faite des patients au phénotype de syndrome de Noonan dont le séquençage n‟a permis de mettre en évidence de mutation. Aucune interprétation ne peut être établie sur un possible rôle du gène PTPN11 dans le développement cardiovasculaire (Zenker 2004).
aucune précision n‟est fournie pour les autres cardiopathies et pour les patients sans mutation du gène (Yoshida 2004).
L‟étude de corrélation de Jongmans contient les mêmes griefs méthodologiques (Jongmans 2005).
Les critères d‟inclusion de chacune des études détaillées ci-dessus expliquent probablement les résultats obtenus :
- L‟étude de Tartaglia mentionne que pour être considéré comme éligible et donc pour que le séquençage soit effectué, le patient doit avoir un phénotype « évocateur » du syndrome de Noonan et que ce patient doit être porteur « d‟une des deux cardiopathies : soit une sténose valvulaire pulmonaire, soit une cardiomyopathie hypertrophique ». Les présences d‟une « déformation sternale » (pectus carinatum ou excavatum) et/ou des « anomalies » à l‟électrocardiogramme sont des critères supplémentaires permettant l‟inclusion à l‟étude.
- L‟étude menée par Zenker et al. se caractérise par un taux très nettement supérieur de détection de mutation. D‟après les auteurs, ceci est dû à une meilleure attribution et caractérisation du phénotype, soulignant l‟importance de critères diagnostics précis : anomalie cardiaque « typique » (sténose valvulaire pulmonaire ou cardiomyopathie) ; une morphologie crânio-faciale « typique » et la présence d‟un « pterygium colli » (palmure formée par la peau du cou).
Parmi plus de 500 patients porteurs du syndrome de Noonan publiés à ce jour, plus de 39 mutations différentes au sein du gène PTPN11 sont maintenant répertoriées. Ces mutations sont toujours des mutations faux-sens sauf pour la survenue d‟une délétion de 3 paires de base (Lee 2004). 98% des mutations surviennent au sein des exons 3,4,7,8,12,13 et la substitution c.922A>G (p.N308D) est prévalente (25%) (Tartaglia 2001 ; Tartaglia 2002 ; Maheshwari
2002 ; Musante 2003 ; Sarkozy 2004 ; Zenker 2004 ; Jongmans 2004 ; Yoshida 2004 ; Sznajer 2007). Il est établi que les patients porteurs de cette mutation c.922A>G (p.N308D) ont un développement psychomoteur normal et suivent l‟enseignement traditionnel (Jongmans 2005). La survenue d‟une délétion de 3 paires de base cause une forme sévère (hydrops fetalis) et est associée à la survenue de leucémie myélomonocytaire juvénile (JMML). La présence de la mutation c.218C>T (p.T73I) est responsable de la survenue de ces mêmes pathologies (Yoshida 2004 ; Tartaglia 2006).
Notre étude, à notre connaissance, est la seule à avoir analysé de manière spécifique la survenue de toutes les cardiopathies chez les patients présentant le syndrome de Noonan. Elle met en évidence le rôle des différentes mutations faux-sens de PTPN11 dans l‟atteinte prévalente des structures cardiaques droites. Elle souligne l‟absence de survenue de cardiopathies du cœur gauche.
2.2. Anomalies moléculaires associées au syndrome LEOPARD
Le second travail de recherche concerne les patients décrits porteurs de lentigines, de surdité, de troubles de la conduction cardiaque et étant alors diagnostiqués porteurs du syndrome LEOPARD. Les résultats des analyses de biologie moléculaire du gène PTPN11 concernent une cohorte composée de 19 patients. Les objectifs sont de détailler les données phénotypiques, de commenter les résultats du séquençage à la lumière de la littérature et des données de biologie moléculaire acquises. La méthodologie utilisée repose sur les mêmes éléments que ceux décrits dans le premier travail.
Résultats
13 patients sur 14 et 5 apparentés diagnostiqués porteurs du syndrome LEOPARD sont identifiés porteurs d‟une mutation au sein du gène PTPN11. Quatre mutations au sein de 2 exons (exons 7 et 12) sont mises en évidence : pour les mutations concernant l‟exon 7 : 6 patients ont la mutation c.836A>G (p.Y279C) et 1 patient a la mutation c.836A>C (p.Y279S); pour les mutations concernant l‟exon 12 : 4 patients ont la mutation c.1403C>T (p.T468M) ; 2 patients ont la mutation c.1529A>C (p.Q510P).
Les manifestations cliniques associées à la présence de la mutation prévalente c.836A>G (p.Y279C) sont la présence de troubles de conduction intra-cardiaque, de surdité et de retard de croissance.
Pour ce qui est des patients porteurs de la mutation c.1403C>T (p.T468M), on observe typiquement la survenue d‟une cardiomyopathie hypertrophique, un retentissement moindre sur le retard de croissance et le retard de développement est moins marqué. Le patient porteur de la mutation c.836A>C (p.Y279S) a développé une leucémie aiguë myéloblastique (mutation non rapportée en 2004). Aucune mutation du gène PTPN11 n‟est mise en évidence pour un patient qui présente des naevi multiples et un habitus marfanoïde.
Aucune donnée phénotypique ne permet de distinguer les patients porteurs de mutation de ceux non porteurs.
Enfin, il faut mentionner que les lentigines peuvent apparaître après plusieurs années de vie, le diagnostic différentiel entre le syndrome de Noonan et le syndrome LEOPARD, chez le nourrisson et le jeune enfant, peut être difficile à établir (Keren 2004).
Discussion
Dans la description originale des patients au syndrome LEOPARD, les manifestations cardiovasculaires sont décrites résultant d‟anomalies de l‟embryogénèse du cœur et/ou des troubles de la conduction électrophysiologique cardiaque (Gorlin 1969). Cependant, ces dysrythmies ne sont pas constantes (Lasonde 1970) et peuvent comprendre un enregistrement donnant un aspect S1, S2, S3 en fin de dépolarisation; des troubles de la repolarisation (QT) ou se révéler lors d‟un arrêt cardiaque secondaire à une fibrillation ventriculaire (Woywodt 1998). Beaucoup plus fréquemment, l‟évaluation clinique aura permis de mettre en évidence un souffle cardiaque justifiant la mise au point et diagnostiquant alors, de manière prévalente, une dysplasie valvulaire pulmonaire. Certains patients développent des anomalies valvulaires sous aortiques ou sous pulmonaires ; d‟autres peuvent avoir une communication inter-auriculaire (Gorlin 1969). L‟histoire naturelle cardiovasculaire des patients présentant le phénotype du syndrome LEOPARD requièrt un suivi longitudinal électrocardiographique et anatomique : ces deux atteintes peuvent apparaître plus tard dans la vie (survenue d‟une cardiomyopathie hypertrophique progressive et tardive) (Woywodt 1998 ; Limongelli 2006).
Les mutations prévalentes au sein du gène PTPN11 associées au syndrome LEOPARD rapportées sont : c.836A>G (p.Y279C), c.1381G>A(p.A461T), c.1391G>C (p.G464A), c.1403C>T (p.T468M), c.1492C>T (p.R498W), c.1517A>C (p.Q506P) et c.1529A>C (p.Q510P). Une équipe italienne a mené une étude de corrélation génotype/phénotype au sein d‟une cohorte de 26 patients (âges : 0 - 63 ans – âge moyen 17 ans) dont 9 présentent une forme familiale de la maladie: 19 patients (73%) sont identifiés porteurs d‟une
L‟hypertrophie ventriculaire provoquait un obstacle à l‟éjection gauche chez 9 patients et du ventricule droit pour 8 patients (30%). Une anomalie valvulaire et une anomalie coronaire sont retrouvées dans 57% et 15% des cas, respectivement. Durant la période de suivi longitudinal (médiane 9 ans) : deux patients ont été victimes d‟une mort subite et 2 patients d‟un arrêt cardiaque secondaire à une hypertrophie myocardique gauche. Les auteurs concluent que de tels événements imposent d‟envisager une approche prophylactique contre le risque de mort subite chez les patients porteurs du syndrome LEOPARD. Les patients non identifiés porteurs de mutation du gène PTPN11 (34%) ont une incidence accrue d‟histoire familiale de mort subite, d‟augmentation de la taille des cavités auriculaires gauches, de brady-arrhythmies, d‟épisodes de tachycardie supraventriculaire, de fibrillation auriculaire et de tachycardie ventriculaire pendant l‟enregistrement Holter. Trois patients de cette cohorte porteurs de mutations au sein de l‟exon 13 ont une cardiomyopathie obstructive sévère (Limongelli 2008).
2.3. Description d'une patiente porteuse conjointement d'une mutation au sein du gène BRAF responsable du syndrome CFC et d'un déficit en Coenzyme Q10
Nous rapportons l‟histoire d‟une patiente associant le phénotype caractéristique du syndrome CFC à un déficit musculaire démontré en Coenzyme Q10. Le coenzyme Q10 est impliqué dans le transport d‟électrons du complexe I et II au complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale (Aeby 2007). Le phénotype de cette patiente est confirmé par l‟analyse du génotype et la mise en évidence de la mutation c.770A>G (p.R257Q) du gène BRAF
survenant de novo puisqu‟absente chez chacun de ses parents. Cette association ne nous semble pas encore avoir été décrite. Les connaissances métaboliques nous autorisent à postuler un lien entre l‟apparition de ces deux présentations chez une même patiente: la biosynthèse du Coenzyme Q requiert le Farnésyl pyrophosphate impliqué dans 4 voies enzymatiques (biosynthèses du cholestérol ; de dolichol, de dolicholphosphate et de géranyl-géranyl-phosphate). Lorsqu‟un substrat métabolique est dosé en quantité