3.5.1. Construção do Painel de SNPs
A determinação dos genótipos foi feita utilizando-se o sistema BeadXpress (Illumina, San Diego, CA) que permite a análise, em média escala, de SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms), em ensaios multiplex (ensaio GoldenGate VeraCode). Foi
desenvolvido um painel de SNPs inicialmente voltado ao estudo de hipertensão nos remanescentes de quilombos. Porém, com a intenção de dar continuidade ao estudo da obesidade nas mesmas populações, foram incluídos no mesmo painel dois SNPs no gene FTO, recentemente associados com fenótipos lipídicos e nunca estudados nessa amostra, e sete SNPs investigados por Angeli et al. (2011), com o intuito de regenotipar as amostras com método mais preciso e também de aumentar a amostra de indivíduos genotipados, incluindo as comunidades de Reginaldo e Poça. No estudo anterior, os genótipos foram determinados por PCR-RFLP e essas duas populações não haviam sido incluídas.
Todos os SNPs e seus respectivos números de identificação (rs) foram reunidos em um arquivo no formato CSV e submetidos à avaliação no site da Illumina (www.illumina.com) para verificar a viabilidade do ensaio multiplex na plataforma do
BeadXpress, por meio de análises in silico. Dos marcadores analisados, foram
selecionados aqueles considerados mais viáveis, de acordo com a análise in silico, resultando em um painel composto por 144 SNPs, localizados em praticamente todos os autossomos e no cromossomo X. A Tabela V mostra apenas os SNPs cujos resultados foram analisados neste trabalho.
Tabela V: SNPs selecionados para estudo da obesidade por meio da tecnologia VeraCode no
BeadXpress (Illumina, San Diego, CA, EUA).
N° dbSNP SNP Cromossomo Gene associado Localização
rs1121980 c.46-34805G>A 16 FTO Intron 1
rs1421085 c.46-43098T>C 16 FTO Intron 2
rs2167270 c.-39G>A 7 LEP 5' UTR
rs1137101 Gln223Arg 1 LEPR Exon 6
rs1042713 Gly16Arg 5 ADRB2 Exon 1
rs7566605 g.118078449C>G 2 Loc100288058/INSIG2 Intergênica
rs2289487 c.46-451G>A 15 PLIN1 Intron 2
rs1862513 c.-216C>G 19 RETN/stxbp2 Intergênica
rs1801282 Pro12Ala 3 PPARG Exon
3.5.2. Ensaio GoldenGate VeraCode for BeadXpress
Amostras de DNA (cerca de 250ng) com concentração aproximada de 50ng/µL foram distribuídas em uma placa com 96 poços, e foram imediatamente ativadas adicionando-se biotina para que se tornassem capazes de se ligar, nas próximas
etapas do ensaio, às partículas paramagnéticas marcadas com estreptavidina. A afinidade da biotina pela estreptavidina permite a captura e recuperação das amostras de DNA em cada etapa de lavagem para retirada do excedente de reagentes não incorporados nas reações, com o auxílio de uma estante magnética, para a qual as partículas paramagnéticas serão atraídas. Após ativação com biotina, a placa é chamada de placa SUD (Single Use DNA).
Em seguida, foi preparada a placa ASE (Allele-Specific Extension), à qual foram adicionados os oligonucleotídeos. Três oligonucleotídeos foram desenhados para cada SNP a ser analisado, cada um contendo sequências complementares ao genoma e uma sequência complementar a sequências de primers universais distintos (P1, P2 e P3). Dois oligonucleotídeos são específicos para cada alelo do SNP (com as sequências complementares aos primers universais P1 e P2) e são chamados de ASOs (Allele-Specific Oligos). O terceiro oligonucleotídeo, chamado de LSO (Locus-
Specific Oligo), hibrida em uma região à jusante do sítio do SNP e contém uma
sequência complementar a um terceiro primer universal (P3) e uma sequência única de bases (Illumi code) que se ligará com um tipo específico de partícula chamada de
VeraCode bead. A Figura 5 representa simplificadamente essa etapa.
Figura 5: Representação dos três oligonucleotídeos utilizados nas primeiras etapas do ensaio. No molde de DNA está representado um sítio de SNP. P1, P2 e P3 representam sequências complementares às sequências de primers universais. ASO (Allele-Specific Oligo). LSO (Locus-Specific Oligo). Illumi code corresponde a uma sequência única que se ligará a um tipo específico de VeraCode bead.
O conteúdo dos poços da placa SUD (amostras de DNA ativadas com biotina) foi transferido para poços da placa ASE (contendo os oligonucleotídeos). A placa ASE foi submetida a um período de incubação para hibridação desses oligonucleotídeos às regiões alvo do DNA genômico. Após algumas lavagens para retirar os ASOs que não se ligaram no DNA, ocorreu adição da enzima (MEL), uma polimerase necessária às reações de extensão dos oligonucleotídeos hibridados. Quando ocorria hibridação perfeita dos ASOs com a sequência genômica complementar, estes eram estendidos em direção ao LSO à jusante por essa polimerase. O segmento estendido a partir do ASO foi ligado ao LSO por meio da ligase. Os produtos resultantes dessa ligação serviram como molde para amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) de fragmentos que incluem os sítios dos SNPs em estudo (Figura 6).
Figura 6: Representação do processo de extensão dos oligonucleotídeos hibridados por meio da polimerase e posterior
Na reação de PCR foram utilizados três
sendo dois destes (P1’ e P2’) marcados com fluorescências (Cy3 e Cy5 respectivamente). Finalmente, os produtos amplificados resultantes da PCR foram combinados com as VeraCode beads
sinais de fluorescência (do Cy3 ou do Cy5) dos fragmentos capturados pelas
VeraCode beads foram lidos pelo equipamento
genotípicos como demonstrado no exemplo
Figura 7: Os fragmentos amplificados resultantes d sequência Illumi code (em verde
Representação do processo de extensão dos oligonucleotídeos hibridados
e posterior ligação desse segmento estendido ao LSO por meio da ligase
Na reação de PCR foram utilizados três primers universais (P1’, P2’ e P3’), sendo dois destes (P1’ e P2’) marcados com fluorescências (Cy3 e Cy5 respectivamente). Finalmente, os produtos amplificados resultantes da PCR foram
VeraCode beads por meio da sequência única do
sinais de fluorescência (do Cy3 ou do Cy5) dos fragmentos capturados pelas foram lidos pelo equipamento BeadXpress, gerando os dados genotípicos como demonstrado no exemplo (Figura 7).
Os fragmentos amplificados resultantes da PCR se ligam às VeraCode beads escuro).
Representação do processo de extensão dos oligonucleotídeos hibridados ao DNA genômico estendido ao LSO por meio da ligase.
universais (P1’, P2’ e P3’), sendo dois destes (P1’ e P2’) marcados com fluorescências (Cy3 e Cy5 respectivamente). Finalmente, os produtos amplificados resultantes da PCR foram por meio da sequência única do Illumi code. Os sinais de fluorescência (do Cy3 ou do Cy5) dos fragmentos capturados pelas , gerando os dados
Os dados de genotipagem gerados foram analisados utilizando o programa
Illumina Bead Studio (Illumina, San Diego, CA, USA) e exemplos de resultados estão
representados na Figura 8.
Figura 8: Exemplo de gráficos gerados a partir das corridas no aparelho BeadXpress. As amostras são agrupadas de acordo com o genótipo obtido. Em vermelho e azul estão os homozigotos e em roxo, os heterozigotos.