T echniques ET PROCÉDURES

IX.2.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

La PCR est une technique permettant d’amplifier par polymérisation in vitro des

séquences d’ADN comprises entre deux amorces nucléotidiques synthétiques spécifiques. Cette technique a été utilisée pour amplifier les gènes codant pour les toxines et antitoxines putatives des systèmes hybrides ainsi que pour construire les séquences ancestrales. Elle est réalisée comme suit. Une colonie isolée de la bactérie contenant le fragment d’ADN à amplifier est bouillie dans lOOpl d’eau durant 5 minutes. Ceci libère l’ADN en partie dans la solution. Pour certaines bactéries, surtout les pathogènes, nous avons reçu l’ADN.

La composition de la solution de réaction est la suivante :

• 2.5 pi du lysat partiel d’une colonie bactérienne bouillie ou de la suspension d’ADN • 0.5 pl d’un oligonucléotide de synthèse (100 pmol/pl)

• 0.5 pl de l’autre oligonucléotide de synthèse (100 pmol/pl) • 0.5 pl de Taq polymérase (Sigma Genosis)

• 1 pl de dNTP (lOmM) (Sigma Genosis) • 5 pl de tampon Taq (10 fois) (Sigma Genosis) • 40 pl d’eau bi-distillée stérile

Le volume final est de 50 pl.

Le programme de PCR suivant a été employé : • 5 minutes à 94°C

• 1 minute à 94°C • 1 minute à 52°C • X minutes à 72°C • 10 minutes à 72°C

Les étapes 2 à 4 sont répétées pendant 30 cycles.

X correspond au nombre de kilobases à amplifier. Un amplicon de 1 OOObp nécessitera, par exemple, un temps d’élongation d’une minute.

IX.2.2. Analyse d’ADN par électrophorèse

La migration des produits de PCR et des restrictions enzymatiques a été réalisée dans des gels 2% d’agarose avec du TAE 1% comme tampon.

IX.2.3. Clonage direct

Cette méthode a été utilisée pour le clonage des gènes des antitoxines. Tout d’abord, on réalise une PCR afin d’amplifier les gènes d’intérêts. Les oligonucléotides de synthèse permettent d’ajouter des sites de restriction de part et d’autre des séquences codant des antitoxines putatives. Après vérification de la présence des amplicons sur gel d’agarose 2%, les produits PCR et le vecteur pBAD-staby ou pKK223-3 ont été digérés par les enzymes de restriction correspondantes.

Composition de la réaction de restriction des produits PCR : • Xpl de produits PCR

• 1 pl de chaque enzyme de restriction

• Ipl du tampon approprié (concentré 10 fois)

• Ypl d’eau bi-distillée afin d’atteindre un volume final de lOpl

X correspond à une quantité suffisante nécessaire à la réaction de ligation. Composition de la réaction de restriction du vecteur :

• 1 pg du vecteur

• 1 pl de chaque enzyme de restriction

• 1 pl du tampon approprié (concentré 10 fois)

• Xpl d’eau bi-distillée afin d’atteindre un volume final de lOpl

La réaction de ligation est effectuée avec lOOng de vecteur restreint. La quantité de produit PCR impliquée dans la ligation est calculée selon la formule suivante :

lOOng de vecteur x taille du produit PCR x 3

taille du vecteur ^{quantité de produit PCR en ng}

La réaction de ligation est effectuée avec : •Ipl de ligase

•Ipl de tampon (lOx)

•Xpl de la réaction de restriction du produit PCR •Ypl de la réaction de restriction du vecteur Le volume final est de lOpl.

Le mélange est incubé pendant une nuit à température ambiante. Ensuite lOpl de la réaction de ligation sont dialysés pendant 15 minutes après quoi on les utilise pour faire Télectroporation dans la souche MC 1061. Les bactéries sont étalées sur milieu LB solide

candidats résistants à cet antibiotique sont cultivés une nuit à 37°C dans 5ml de milieu LB liquide contenant l’antibiotique. Les vecteurs des candidats sont purifiés en suivant le protocole miniprep. La présence de l’insert dans le vecteur est vérifiée par restriction au moyen des enzymes de restriction utilisées lors du clonage. Les restrictions sont analysées sur gel d’agarose 1%. Des vecteurs candidats contenant l’insert sont alors séquencés afin de s’assurer qu’aucune mutation n’a été insérée lors de la PCR.

IX.2.4. Clonage dans le vecteur pCR-XL-TOPO

Le clonage des fragments PCR a été réalisé selon le protocole appelé TOPO XL cloning (version H) commercialisé par INVITROGEN. 11 permet d’insérer en une étape un fragment PCR dans le vecteur pCR-XL-TOPO, en l’occurrence, les gènes codant les toxines putatifs et les produits PCR des fusions. La présence de l’insert dans le vecteur est vérifiée par restriction en utilisant les enzymes de restriction qui coupent dans les sites de restriction ajoutés lors de l’étape d’amplification. Les restrictions sont analysées en les en faisant migrer sur gel d’agarose 1%. Les vecteurs contenant l’insert sont alors séquencés afin de s’assurer qu’ils ne sont pas mutés.

IX.2.5. Clonage shotgun

Cette méthode a été utilisée pour le clonage des gènes des toxines putatives ainsi que pour les séquences ancestrales. Les vecteurs pCR-XL-TOPO contenant les inserts sont restreints avec les enzymes de restrictions correspondants aux sites de restrictions ajoutés aux gènes grâce aux oligonucléotides, lors de l’étape d’eimplification. Les vecteurs pBAD33 et pKK223-3 ont été restreints par les mêmes enzymes que les inserts que l’on voulait y cloner.

Le protocole suivant a été suivi pour effectuer les restrictions. Composition de la réaction de restriction du vecteur pCR-XL-TOPO contenant l’insert:

• 2\ig du vecteur pCR-XL-TOPO

• Ipl de chaque enzyme de restriction

• Ipl du tampon approprié (concentré 10 fois)

• Xpl d’eau bi-distillée afin d’atteindre un volume final de lOpl.

Le mélange est incubé pendant 2 heures à 37°C (ou autre température suivant les enzymes). Les enzymes de restriction sont inactivées en incubant la restriction pendant 20 minutes à 80°C.

La qualité de la restriction a été vérifiée en faisant migrer, sur gel d’agarose 1%, Ipl de la restriction. Celle-ci est conservée la restriction à 4°C.

Composition de la réaction de restriction des vecteurs pBAD33 et pKK223-3 : • 3pg du vecteur

• 1 pi de chaque enzyme de restriction

• Ipl du tampon approprié (concentré 10 fois)

• Xpl d’eau bi-distillée afin d’atteindre un volume final de lOpl

Le mélange est incubé pendant 1 heure à 37°C (ou autre température suivant les enzymes).

Puis, vérifier la qualité de la restriction en faisant migrer, sur gel d’agarose 1%, Ipl de la restriction. Ajouter au reste de la restriction Ipl de la phosphatase alcaline et incuber 1 heure à 37°C. Inactiver les enzymes de restriction en incubant la restriction pendant 20 minutes à 80°C. Conserver la restriction à 4°C.

La réaction de ligation est effectuée avec lOOng de l’insert. La quantité de vecteur pCR-XLTOPO-insert en ng impliquée dans la ligation est calculée selon la formule suivante :

lOOng de vecteur x taille du pCR — XL — TOPO — insert x 3 taille du vecteur

La réaction de ligation est effectuée avec ; • 1 pl de ligase

•Ipl de tampon (lOx)

•Xpl de la réaction de restriction du produit PCR •Ypl de la réaction de restriction du vecteur Le volume final est de lOpl.

Le mélange est incubé pendant une nuit à température ambiante. Ensuite lOpl de la réaction de ligation sont dialysés pendant 15 minutes avant de les utiliser pour faire l’électroporation dans la souche MC1061. Les bactéries sont étalées sur milieu LB solide contenant l’antibiotique relatif au vecteur utilisé (chloramphénicol pour le pBAD33 ou ampicilline pour le pKK223-3). Des candidats résistants à ces antibiotiques sont cultivés une nuit à 37°C dans 5ml de milieu LB liquide contenant l’antibiotique propre au vecteur sélectionné. Les vecteurs des candidats sont purifiés en suivant le protocole miniprep. La présence de l’insert dans le vecteur est vérifiée par restriction en utilisant les enzymes de restriction qui coupent dans les sites de restriction ajoutés lors de l’étape d’amplification. Les restrictions sont analysées en les en faisant migrer sur gel d’agarose 1%. Des vecteurs

IX.2.6. Extraction des plasmides

L’extraction et la purification des plasmides ont été réalisées en utilisant le kit «miniprep» commercialisé par SIGMA-GENOSIS.

IX.2.7. Séquençage

Les échantillons à séquencer ont été envoyés chez Génome Express qui a réalisé l’analyse de réactions de séquençage. La technique de séquençage est celle des didésoxynucléotides (ddNTPs).

IX.2.8. Préparation de bactéries électrocompétentes

Cette technique permet de perméabiliser des bactéries pour qu’elles laissent pénétrer de l’ADN exogène. Lors d’un choc électrique, ces bactéries sont susceptibles d’incorporer une molécule d’ADN exogène (par exemple : un plasmide). On réalise une préculture de nuit en milieu LB de la bactérie d’intérêt. Le lendemain, on inocule cette culture avec une dilution de 100 fois dans 500 ml de milieu de culture LB puis on laisse croître les bactéries jusqu’à obtenir une DO à ôOOnm d’environ 0.5. Les cultures sont alors transférées dans des biberons de 500 ml que l’on centrifuge durant 30 minutes à 4500 rpm à 4°C. Le culot est resuspendu dans 250 ml d’eau bi-distillée et on centrifuge les biberons une deuxième fois dans les mêmes conditions avant de resuspendre le culot dans 125 ml d’eau bidistillée et de centrifuger une troisième fois dans les mêmes conditions. On resuspend ensuite le culot dans 5 ml d’eau bi­ distillée 10% glycérol et on centrifuge une dernière fois durant 10 minutes à 8000 rpm. Après avoir resuspendu le culot dans 500 pl de glycérol 10%, on répartit lOOpl dans des tubes eppendorfs que l’on conserve à -80°C.

IX.2.9. Électroporation

L’électroporation permet de faire pénétrer de l’ADN dans des bactéries rendues électrocompétentes. Le protocole suivi est celui fourni par INVITROGEN.

IX.2.10. Transformation de bactéries par un plasmide : méthode au TSS

Cette transformation est moins efficace que l’électroporation, elle a été utilisée pour transformer des bactéries avec un plasmide purifié par miniprep. On réalise une préculture de nuit en milieu LB avec éventuellement les antibiotiques adéquats. Le lendemain, on relance la culture de nuit en milieu LB avec les éventuels antibiotiques nécessaires et on attend jusqu’à

ce que la culture atteigne une DO à 600 nm d’environ 0.3. On la centrifuge alors durant 5 minutes à 3000 rpm et on resuspend le culot dans 0.1 ml de TSS glacé par ml de culture centrifugée. lOOp.1 de la suspension bactérienne sont alors mélangés avec 100 à 200 ng d’ADN plasmidique et le mélange de transformation est incubé 30 minutes sur glace. On ajoute ensuite lOOpl de milieu LB liquide et on incube le tout à 37°C pendant une heure. On étale ensuite lOOp.1 du mélange de transformation et lOOp.1 d’ime dilution lOx sur boîte LB contenant l’antibiotique dont la résistance est codée par le plasmide. Si la souche contenait déjà im autre plasmide, l’antibiotique adéquat doit être ajouter au milieu. Les boîtes sont incubées pendant une nuit à 37°C.

IX.2.11 Tests de toxicité et d’antitoxicité sur boîte

Afin de tester la toxicité des séquences de toxines putatives, celles-ci ont été clonées au sein d’un plasmide pBAD33 et transformées dans la souche DJ624. Les bactéries transformantes ont été étalées sur boîtes LB contenant du chloramphénicole et 1% de glucose ou d’arabinose. Les toxines fonctionnelles doivent pousser sur les boîtes contenant du glucose, pas sur les boîtes contenant de l’arabinose.

Afin de tester la capacité des antitoxines correspondantes à contrecarrer ces toxines, elles ont été clonées au sein d’un plasmide pKK223-3 et transformées dans un premier temps dans un premier temps dans la souche MG1655. Les bactéries transformantes ont été étalées sur des boîtes LB contenant de l’ampicilline et 1% d’IPTG ou non. Ces séquences n’étant pas censées être toxiques, les bactéries doivent pousser sur les deux types de boîtes. Dans un deuxième temps, les plasmides ont été transformés dans des bactéries contenant également le vecteur portant la toxine correspondante. Les transformantes ont été étalées sur LB contenant du ehloramphénicole, de l’ampicilline, et soit 1% d’arabinose et d’IPTG, soit 1% de glueose. Dans les deux cas, si l’antitoxine est fonctionnelle, les bactéries doivent pousser, puisqu’en présence d’arabinose et de glueose, les deux protéines de toxine et d’antitoxine sont exprimées, et qu’aueune des deux ne l’est dans l’autre cas.

IX.2.12 Tests d’induction de la réaction SOS

La souche MG1655 }sjîA::lacZ est transformée par le vecteur (pBAD33) contenant la

toxine a analyser. Les transformants sont eultivés ime nuit à 37°C sous agitation, dans 5mL de milieu CM contenant du chloramphénicol et du glucose. Ces cultures sont ensuite diluées

600nm de 0,1. Les cultures sont alors lavées avec du milieu CM puis resuspendues dans du CM contenant du chloramphénicol et de l’arabinose. Aux temps 0, 30, 60 et 120 minutes, lOOpL d’échantillon de ces cultures sont prélevés. Chaque échantillon est immédiatement placé dans les puits d’une plaque 96 puits contenant 50pL de tampon de lyse. Après que toutes les prises ont été faites, la plaque est laissée sxar glace pendant 15 minutes puis incubée 15 minutes à 28°C pour permettre la lyse des bactéries. lOOpL de solution d’ONPG (orthonitrophényl-P-D-galactopyranoside) sont ajoutés dans chaque puits. Les mesures

d’activité enzymatique sont réalisées par la machine versa MAX MICRO PLATE READER

(Molecular Devices). Le gène lacZ étant fusionné au gène sfiA, impliqué dans la réponse SOS,

son activité traduit celle de sfiA. Cette activité de lacZ correspond au clivage de l’ONPG en

un composé de couleur jaune, et est donc suivie par la machine par mesures de densité optique.

IX.2.13 Tests d’incorporation d’acides aminés radioactifs

Afin de déterminer le taux de traduction, des mesures d’incorporation d’acides aminés radioactifs ont été réalisées. Des cultures nocturnes de bactéries contenant le plasmide portant la toxine d’intérêt sont réalisées en milieu CM contenant du chloramphénicol. Ces cultures sont diluées pour obtenir une DO de 0,01 puis incubées lh30 à 37°C. Pour chaque souche, deux cultures différentes sont faites : une « chaude » contenant im mélange d’acides aminés marqués radioactivement au tritium (^H), et une « froide » qui ne contient pas ce mélange. De l’arabinose est ajouté à ce milieu afin d’induire l’expression de la toxine. Des prises sont réalisées à différents temps. À chaque prise est ajoutée du TCA (acide trichloroacétique) afin de lyser les bactéries. Deux lavages à l’acétone sont réalisés. Les culots contenant l’ensemble des protéines synthétisées durant l’expérience sont finalement séchés à l’air libre avant d’être resuspendus dans un tampon. 45pL de chaque resuspension sont ajoutés à lOmL de liquide de scintillation qui permet d’amplifier le signal émis par les acides aminés radioactifs. Ce signal est mesuré dans un compteur à scintillation.

Si la traduction fonctionne normalement, la radioactivité mesvuée (en coups par minute, CPM) sera importante, alors qu’elle sera presque nulle si la traduction est affectée par la toxine.

IX.2.14 Reconstruction de séquences ancestrales in silico

La reconstruction de séquences ancestrales a été réalisée grâce au programme paml

v.4.2 [152, 153]. Les phylogénies nécessaires ont été obtenues grâce à la version en ligne, sur

le portail CIPRES [154], du programme raxml [26, 155]. Quant aux alignements requis pour

ces phylogénies, ils ont été obtenus grâce au programme mafft mentioimé en Introduction

(paramètres par défaut, algorithme G-iNS-i).

IX.2.15 Reconstruction de séquences ancestrales in vivo

Le protocole utilisé est strictement celui décrit par Belinda Chang dans le livre

Résumé

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont composés de deux gènes organisés en opéron retrouvés chez la quasi-totalité des bactéries ainsi que chez les archées. Ils ont été découverts sur des plasmides, où ils induisent une tuerie post-segregationnelle (PSK). En effet, l’antitoxine est instable car elle est dégradée par une protéase ATP dépendante. Lors de la réplication, si un plasmide portant un système TA n’est pas transmis à la cellule fille, celle- ci recevra tout de même une partie du cytoplasme de la cellule mère qui contenait des

protéines de toxine et d’antitoxine. Cette dernière étant instable, et sans synthèse de novo, la

toxine va se retrouver libre d’affecter sa cible cellulaire. Un système TA crée donc une addiction au plasmide qui le porte, stabilisant celui-ci.

Les systèmes TA se retrouvent également, dans un nombre de copies variable, au sein du chromosome. Dans ce cas, plusieurs hypothèses existent quant à leur fonction, comme la mort cellulaire programmée, la réponse au stress, la stabilisation de régions génomiques non essentielles, ou T anti-addiction au plasmide.

L’origine et l’évolution des systèmes TA restent inconnues, alors qu’ils présentent des aspects intrigants. En effet, les toxines CcdB et MazF ont des séquences et des activités toxiques très différentes, malgré une structure proche ; les toxines RelE et ParE présentent des séquences proches, mais des fonctions différentes. À l’heure actuelle, les deux hypothèses concernant l’origine évolutive des systèmes TA sont soit qu’ils seraient tous issus d’un ancêtre commun, soit qu’ils auraient été réinventés plusieurs fois au cours de l’évolution, à partir d’un nombre limité de gènes.

Au cours de cette thèse, nous avons abordé la question de l’origine et l’évolution des systèmes TA de plusieurs manières : par la reconstruction de phylogénies et de séquences ancestrales, et par l’étude d’un système chromosomique particulier au sein de nombreuses

souches d'Escherichia coli. Enfin, nous nous avons décidé d’analyser le contexte génomique

des systèmes TA chromosomiques. Ces travaux ont notamment permis de mieux comprendre l’évolution des systèmes TA, et de conforter l’hypothèse selon laquelle ils seraient des éléments égoïstes, évoluant au sein des génomes sans gain d’aptitude pour l’hôte.