Recherche d’un marqueur métabolique discriminant le phénotype radiorésistance

Au vu de ces résultats, nous avons décidé d’augmenter le nombre de lignées cellulaires de glioblastomes humains pour notre étude. Ainsi, nous avons étudié les cellules SF763 RR et SF767 RS (respectivement 90% et 55% de survie de ces cellules après une irradiation de 2 Gray)148.

3.2.6.1 Analyse statistique multivariée.

Pour ces deux lignées supplémentaires, avant d’effectuer l’analyse quantitative, nous avons utilisé l’ACP dans un but de simplification des données, pour voir rapidement s’il existait une discrimination des lignées RR et RS (Figure 2.14).

U87 RR U251 RS GPC PC U87 RR U251 RS GPC PC CP2 CP2 CP1 CP1

Figure 2.14: Représentations des individus et des variables suivant les composantes

principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H de la fraction hydrosoluble des extraits cellulaires de glioblastomes. En noir: U87 RR; en bleu: SF763 RR; en rouge: U251 RS et en vert: SF767 RS.

L’ACP de l’ensemble des lignées cellulaires montre qu’il y a trois clusters. Le premier cluster (en noir) rassemble les échantillons provenant des cellules U87 RR et le second cluster (en bleu) les échantillons provenant des cellules SF763 RR. Le troisième cluster rassemble la totalité des échantillons provenant des cellules RS à savoir U251 RS et SF767 RS. La séparation des groupes selon les composantes principales CP1 et CP2 s’effectue majoritairement grâce aux signaux situés à 3,22 et 3,23 ppm correspondant à la PC et à la GPC et, dans une moindre mesure, au signal situé à 3,78 ppm correspondant à la fois à l’un des signaux du glutamate, de la glutamine et du glutathion. Il est donc possible de séparer les souches RR des souches RS bien que les deux lignées RR forment deux clusters bien distincts.

3.3.6.2 Analyse quantitative.

L’ACP nous a permis de mettre l’accent sur la zone du spectre correspondant aux composés à choline (3,20 à 3,24 ppm). L’analyse classique du spectre RMN par intégration des signaux permet d’analyser plus en détail cette zone pour les 4 lignées de glioblastomes étudiés. Ainsi, nous avons comparé spécifiquement la proportion de PC et de GPC présente dans chaque lignée (Figure 2.15 et Tableau 2.4).

U87 RR SF763 RR SF767 RSU251 RS 3,23 3,22 3,78 U87 RR SF763 RR SF767 RSU251 RS U87 RR SF763 RR SF767 RSU251 RS 3,23 3,22 3,78 3,23 3,22 3,78 CP1 CP1 CP2 CP2

Figure 2.15: Aires relatives de la phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine

(GPC) de quatre lignées cellulaires de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n = 5 pour chaque lignée).

Tableau 2.4: Aires relatives de la phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine

(GPC) de quatre lignées cellulaires de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n = 5 pour chaque lignée).

U87 RR SF763 RR U251 RS SF767 RS

PC 3,9 ± 0,4 13,6 ± 1,8 4,5 ± 0,2 3,1 ± 0,4

GPC 6,9 ± 1,0 1,0 ± 0,2 1,1 ± 0,1 0,2 ± 0,0

PC/GPC 0,58 ± 0,02 13,83 ± 2,48 4,46 ± 1,00 19,33 ± 7,07

La proportion de PC est nettement plus élevée dans les cellules SF763 RR que dans l’ensemble des autres cellules. Par contre, la proportion de GPC est très importante dans les cellules U87 RR et est quasi inexistante dans les cellules SF767 RS.

La GPC qui, lors de l’étude préliminaire, nous semblait être un marqueur de la radiorésistance des glioblastomes n’en est finalement pas un. Quand au rapport PC/GPC, il est de 0,58 ± 0,02 dans les cellules U87 RR et il est nettement supérieur à 2 dans les trois autres lignées (13,83 ± 2,48 pour les SF763 RR, 4,46 ± 1,00 pour les U251 RS et 19,33 ± 7,07 pour les SF767 RS). 0 0,05 0,1 0,15 0,2 PC GPC Métabolites. A ir e s r e la ti v e s (% ) U87 RR SF763 RR U251 RS SF767 RS

Si nous observons les résultats non plus du point de vue des lignées cellulaires mais du point de vue des phénotypes RR et RS, phénotype que nous essayons de déterminer, alors nous pouvons voir que ni PC ni GPC ne permettent de caractériser les deux groupes (Figure 2.16 et Tableau 2.5). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Glu Cho PC GPC PC GPC Cho PC GPC

Métabolites. A ir es r el at ive s (%) RR RS * * *

Figure 2.16: Concentrations relatives du glutamate (Glu), de la choline (Cho), de la

phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine (GPC) des lignées radiosensibles et radiorésistantes de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n=10 pour chaque groupe) (*: p<0,05).

Cependant, la proportion de composés à cholines dans les extraits peut être utilisé comme paramètre de discrimination. En effet, pour les lignées RR (U87 et SF763), le pourcentage de composés à cholines est de 14, 1 ± 3,7% alors qu’il est seulement de 5,5 ± 1,8% pour les lignées RS (U251 et SF767). On peut aussi noter une variation significative de la proportion de glutamate qui est plus élevée dans les cellules RS.

Tableau 2.5: Concentrations relatives du glutamate (Glu), de la choline (Cho), de la

phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine (GPC) des lignées radiosensibles et radiorésistantes de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n=10 pour chaque groupe). RR RS Glu 6,3 ± 0,9 11,0 ± 2,0 Cho 1,2 ± 0,6 0,9 ± 0,7 PC 9,2 ± 5,7 3,8 ± 1,00 GPC 3,7 ± 3,3 0,6 ± 0,6 PC+GPC 12,9 ± 3,8 4,5 ± 1,4 Cho+PC+GPC 14,1 ± 3,7 5,5 ± 1,8 3.3 Conclusion.

Le profil métabolique caractéristique de chaque lignée a été déterminé. Il traduit la modification de la concentration relative de certains métabolites comme le glutamate et, de façon prédominante, des composés à choline (PC et GPC).

L’ACP permet de discriminer les deux phénotypes. Ainsi, les lignées radiorésistantes (U87 et SF763) se différencient des lignées radiosensibles (U251 et SF767). Il semblerait qu’il existe un lien entre la résistance de ces lignées cellulaires à l’irradiation et le taux de dérivés de la choline présents dans les extraits cellulaires de glioblastomes.

Ce travail mené sur quatre lignées cellulaires de glioblastomes a été renouvelé avec un protocole légèrement différent: utilisation d’une solution tampon borate à pH 10 au lieu de 8,5, diminution des volumes d’extraction, variation de la méthode d’intégration et changement d’expérimentateur. Les résultats ont été confirmés.

A ce niveau de l’étude, de nombreuses voies sont maintenant à explorer. Tout d’abord, il serait intéressant d’augmenter sensiblement le nombre de lignées cellulaires de glioblastomes afin de confirmer la véracité du biomarqueur comme marqueur métabolique de la radiorésistance. Aussi, il convient maintenant de rechercher, à un niveau biochimique en amont (gène, ARN et activité enzymatique), d’où proviennent ces différences afin de mettre éventuellement en évidence des mécanismes impliqués dans la radiorésistance de certaines de ces tumeurs. Pour cela, des travaux sur les enzymes du cycle de formation de la phosphatidylcholine ainsi que des études transcriptomique et lipidomique sont en cours de

réalisation. Une autre perspective consiste à vérifier les résultats obtenus avec les lignées cellulaires sur des biopsies de tumeurs cérébrales par RMN HR-MAS ou RMN conventionnelle des extraits tissulaires. Le suivi des patients qui vont subir un traitement radiothérapeutique devra nous permettre de vérifier cliniquement si le marqueur que nous avons défini peut être utilisé comme outil d’aide au diagnostic. Si cela est avéré, il pourra être utilisé pour aider les médecins dans le choix du traitement à effectuer. Ainsi, si la tumeur est radiorésistante, cela pourra permettre au patient d’éviter un traitement radiothérapeutique lourd dont l’efficacité sera faible.

4. Analyse métabonomique des modifications précédant l’insuffisance cardiaque

chez le rat SHHF obèse.

4.1 Introduction.

L’obésité est définie par l’augmentation de la masse graisseuse et se caractérise par un indice de masse corporelle supérieur à 30 kg.m-2 159. Elle touche 10 à 30% de la population des pays industrialisés et tend à doubler tous les 10 ans160. Cette pathologie constitue aujourd’hui un facteur de risque majeur de l’insuffisance cardiaque (IC). Elle augmente le taux de mortalité ainsi que le taux de morbidité pour le diabète de type II161. En dépit de récentes avancées thérapeutiques, le pronostic de l’IC reste mauvais (35% de mortalité à 5 ans). Si les modifications hémodynamiques et hormonales induites par l’obésité sont aujourd’hui reconnues, les mécanismes moléculaires sous-jacents conduisant au développement de l’IC restent peu connus.

Un des effets à long terme de l’obésité se caractérise notamment par une hypertrophie ventriculaire gauche162. Dans une étude réalisée sur des biopsies de cœur humain, il a été montré que les patients obèses et hypertendus avaient un profil d’expression génique clairement différent de celui des patients hypertendus163. L’étude que nous présentons sur un modèle animal s’intègre au projet de caractérisation des modifications du transcriptome et du métabolome induites par l’obésité chez l’homme et qui influent sur le développement de l’IC.

Deux groupes d’animaux, rats spontanément hypertendus et développant une IC (rat SHHF) obèses (mutation du gène du récepteur à la leptine = homozygote ObR-/-) et maigres (hétérozygotes ObR-/+) ont été utilisés pour cette étude. Les rats ObR-/- (obèses dès 4 mois) développent une IC après 14 mois alors que les rats ObR-/+ développent une IC après 16 mois. Les cœurs provenant des rats obèses ou maigres ne présentent aucune différence morphologique et sont de poids identiques pour un âge donné. Le tissu du ventricule gauche provenant des cœurs d’animaux sacrifiés à 4 et 10 mois a été utilisé pour une analyse métabonomique (évolution du contenu en métabolites hydrosolubles et lipides) par RMN 1H 164.