Résultats préliminaires

Les quatre amides de la Leu-enképhaline ont été remplacés séquentiellement et systématiquement par des alcènes, des esters, des N-méthylamides et des thioamides. Par la suite, l’affinité et l’activité sur le récepteur δ ont été testées. Les résultats obtenus ont été publiés dans ACS Chemical Neuroscience.84,87

L’affinitié des molécules peptidomimétiques pour le récepteur δ a été mesurée par des essais de liaison compétitive avec la deltorphine II tritiée à 1 nM sur une préparation de membrane de cellules GH3 exprimant le récepteur δ (Tableau 1). Les deux composés compétitionnant pour la même cible, la liaison de la deltorphine II tritiée est inhibée d’une manière dépendante de la concentration par la molécule peptidomimétique. La valeur de la constante d’inhibition (Ki) représente la concentration de

molécule peptidomimétique théoriquement requise pour occuper la moitié des récepteurs, si le radioligand (deltorphine II) n’était pas présent. Elle se mesure selon l’équation : Ki = IC50 / (1+([L]/Kd))

où Ki représente la constante d’inhibition, IC50 représente la concentration requise de composé

peptidomimétique pour inhiber 50% de la liaison du radioligand, [L] représente la concentration du radioligand et Kd représente la constante de dissociation du radioligand.

Tableau 1. Valeurs de Ki exprimées en nanomoles par litres (nM) pour les composés peptidomimétiques de la Leu-Enképhaline.a

Substituant Amide 1 Amide 2 Amide 3 Amide 4

Leu-enképhaline 6,3 ± 0,9

Alcène b 13,1 ± 6,2 761 ± 32 587 ± 19 196 ± 29

Ester b 150 ± 40 300 ± 130 34 ± 17 11,9 ± 4,0

N-méthylamide c 1200 ± 250 ˃ 10 000 530 ± 140 12,6 ± 5,0 Thioamide d _{70 ± 4 1,5 ± 0,4 28,6 ± 5,2}e _{9,2 ± 2,0}e

a) Travaux effectués par Kristina Rochon. b) Synthèses effectuée par Arnaud Proteau-Gagné. c) Synthèses effectuées par Philippe Bourassa. d) Synthèses effectuées par Guillaume Langlois. e) Analyses pharmacologiques effectuées par Alexandre Osborne et Mélyssa Roy.

L’activité des molécules peptidomimétiques a été mesurée de deux façons. La première, un essai d’inhibition de la contraction du mouse vas deferens, mesure la concentration de composé peptidomimétique requise (EC50) pour inhiber 50% de la contraction du canal déférent de souris

lorsqu’un courant électrique le traverse (Tableau 2).

Tableau 2. Valeurs de EC50 (Mouse vas deferens) exprimées en nanomoles par litres (nM) pour les

composés peptidomimétiques de la Leu-Enképhaline.a

Substituant Amide 1 Amide 2 Amide 3 Amide 4

Leu-enképhaline 72 ± 4

Alcène b 83 ± 13 ˃ 10 000 8300 ± 1000 1800 ± 180

Ester b 542 ± 11 ˃ 10 000 257 ± 36 143 ± 5

N-méthylamide c ˃ 10 000 ˃ 10 000 2330 ± 415 35 ± 14

Thioamide d 920 ± 210 47 ± 18 2250 ± 790 187 ± 15

a) Travaux effectués par Kristina Rochon. b) Synthèses effectuée par Arnaud Proteau-Gagné. c) Synthèses effectuées par Philippe Bourassa. d) Synthèses effectuées par Guillaume Langlois.

La seconde implique des essais sur l’induction de la phosphorylation de ERK 1 et ERK 2, une des voies de signalisation activée suivant la liaison avec le récepteur δ, en utilisant des cellules DRGF11 (Tableau 3). Dans le cas de la Leu-enképhaline, l’effet maximal est observé après 5 minutes. Les composés ont donc été testés après 5 minutes d’interaction avec le récepteur, avec des concentrations allant de 10-9 M à 10-5 M. Les valeurs rapportées dans le tableau sont l’opposé du logarithme de la concentration minimale requise pour l’observation de la phosphorylation de ERK 1 et ERK 2.

Tableau 3. Résultats des essais ERK 1/2 exprimées en opposé du logarithme de la concentration minimale requise pour la phosphorylation des kinases (en M) pour les composés peptidomimétiques de

la Leu-Enképhaline.a

Substituant Amide 1 Amide 2 Amide 3 Amide 4

Leu-enképhaline 7

Alcène b 6 Inactif 5 5

Ester b 7 5 6 7

N-méthylamide c Inactif Inactif 6 7

Thioamided 7 8 7 e 7 e

a) Travaux effectués par Kristina Rochon. b) Synthèses effectuée par Arnaud Proteau-Gagné. c) Synthèses effectuées par Philippe Bourassa. d) Synthèses effectuées par Guillaume Langlois. e) Analyses pharmacologiques effectuées par Alexandre Osborne et Mélyssa Roy.

Selon les résultats d’affinité et d’activité sur le mouse vas deferens, la seule substitution tolérée pour le premier amide est la substitution par un alcène trans, quoique la substitution à cette position par un thioamide mène à un composé ayant une certaine affinité avec le récepteur δ. Le second lien amide, lorsqu’il est substitué par un thioamide, mène à un peptide ayant une meilleure affinité et une meilleure activité que la Leu-enképhaline, alors que toute autre substitution du deuxième amide cause une perte importante d’affinité, ainsi qu’une perte totale d’activité, ce qui pourrait indiquer que le deuxième amide joue un rôle de donneur de pont hydrogène. La substitution du troisième amide a mené à une perte d’affinité et d’activité, quoique les peptides contenant un ester ou un thioamide à cette position gardent une certaine affinité pour le récepteur δ. Ceci pourrait indiquer que le troisième amide joue un rôle en tant qu’accepteur et donneur de pont hydrogène. Il pourrait aussi être impliqué en tant qu’accepteur de pont hydrogène tout en étant très sensible à l’encombrement stérique, tel que démontré par les grandes pertes d’activité et d’affinité dans le cas du N-méthylamide. Finalement, la substitution de l’amide 4 par un ester, un N-méthylamide ou un thioamide est tolérée, et le peptide résultant de la substitution par le N-méthylamide a une meilleure activité sur le mouse vas deferens que la Leu- enképhaline, ce qui pourrait indiquer que le quatrième amide joue un rôle d’accepteur de pont hydrogène.

Les essais sur ERK 1/2 indiquent que la substitution par l’alcène mène toujours à une perte d’activité, la première position étant la moins sensible et la seconde étant la plus sensible. La substitution par les

esters et les thioamides ont mené à des composés ayant tous la capacité de causer la phosphorylation de ERK 1 et ERK 2, les molécules peptidomimétiques contenant des esters en position 1 et 4 ayant une activité semblable à celle de la Leu-enképhaline (des pertes sont observées aux autres positions) et les molécules peptidomimétiques contenant des thioamides sont tous (sauf dans le cas du thioamide en position 2, qui a une meilleure activité) comparables à la Leu-enképhaline. La substitution par les N- méthylamides semble ne pas être toléré aux positions 1 et 2, cause certaines pertes d’activité en position 3 et mène à une activité comparable à celle de la Leu-enképhaline en position 4.