Une puce, ou microarray, est un outil permettant de mesurer simultanément le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes. La puce est composée d’une multitude de molécules d’ADN -les sondes- fixées sur un support solide de petite taille (moins de 2 cm²). Ces sondes sont de courtes séquences (environ 20 nucléotides) spécifiques de leur gène cible. La technique est basée sur le principe de ré-appariement spontané de séquences nucléotidiques complémentaires par création de liaisons hydrogène. Les puces utilisées au cours de cette étude sont des GeneChip Rat Gene 1.0 ST array (#901173 – Affymetrix). Elles peuvent interroger dans un échantillon la présence de 24 000 gènes (sur environ 26 000 gènes totaux chez le rat) avec en moyenne 22 sondes par gènes, permettant une étude prospective du transcriptome selon les conditions de traitement des échantillons. En effet, pour refléter l’expression des gènes à un moment défini, les ADNc issus de la rétrostranscription des ARN seront hybridés sur les sondes portées par la puce. Nous avons utilisés comme échantillons des « pools » d’ovaires extraits d’animaux âgés de 1 jour et traités 4 heures après leur naissance soit avec de l’huile de maïs, soit avec de l’E2 [10 µg], soit E2 [0.1 µg] et disséqués à 24 heures. Chaque pool contient entre 8 et 12 ovaires issus de 5 à 12 animaux. Deux puces ont été réalisées pour chaque dose, utilisant les ARN de deux pools différents. Les ovaires récupérés sur les animaux à 1 jpn sont congelés par pools à -80°C en attendant d’être utilisés. Les ARN totaux sont extraits selon le protocole décrit précédemment.
i. Contrôle qualité des ARN
Seuls des ARN purs et intègres peuvent être utilisés. Ces deux paramètres sont donc vérifiés au moyen de « puces Agilent » (RNA 600 Nano) sur un bioanalyseur (Agilent 2100). La puce Agilent (figure 44) est un outil miniaturisé composé de 16 puits, dont 12 destinés aux échantillons et 1 au marqueur de poids moléculaire. Les puits sont interconnectés par des microréseaux. On dépose d’abord dans l’un des puits un gel d’électrophorèse filtré qui grâce aux microréseaux se répartit sur toute la puce (« électrophorèse capillaire »). Ce gel est enrichi en agent intercalant capable de marquer les molécules d’ARN. Un tampon est ensuite ajouté dans chaque puits afin de garantir aux ARN un milieu favorable (notamment en termes de pH, afin de ne pas les endommager). Un marqueur de poids moléculaire est ajouté dans le puits dédié. Les échantillons sont déposés dans les 12 puits prévus à cet effet. Cette technique permet une analyse fine de la qualité et de la concentration d’ARN sur une très petite quantité d’échantillon (environ 300 ng). Une fois prête, la puce est vortexée puis installée dans le bioanalyseur. L’analyse totale dure environ 30 minutes au cours desquelles les puits sont analysés un par un en commençant par celui contenant le marqueur de poids moléculaire. Une électrode entre en contact avec chaque puits et l’application d’un champ électrique (comme lors d’une électrophorèse classique) permet la séparation des brins d’ARN selon leur taille et leur migration plus ou moins rapide à travers le microréseau. En circulant dans le gel, les ARN se lient avec l’intercalant. À la fin du circuit, les molécules sont détectées par fluorescence grâce à l’intercalant. L’appareil mesure l’intensité de fluorescence émise en fonction du temps de rétention
Synthèse ADNc Synthèse ARNc Purification Synthèse ADNc Traitement RNAse Purification Fragmentation Marquage biotine Hybridation « Puce » Lavages Marquages Lavages Face Dos Septum « aération » Septum d’injection Lecture 570 nm Traitement informatique ARNtotaux Biotine Strepta PE Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 3 → 4 Jour 4
Figure 45 : Puces à ADN - Microarray
Les ARN sont soumis à 2 cycles de rétrotranscription / transcriptions in vitro. Puis les ADNs obtenus
sont fragmentés, marqués à la biotine et hybridés sur la puce composée de sondes greffées sur un support inclus dans une « chambre » munie de 2 ouvertures, les septa d’injection et d’aération. Une
de l’échantillon dans le microréseau (les fragments longs sont retenus plus longtemps que les courts et plus il y a d’ARN, plus la fluorescence émise est importante). Le temps de rétention et l’intensité de fluorescence sont comparés aux valeurs générées par le marqueur de poids moléculaire. Le bioanalyseur attribue un « RNA Integrity Number » (RIN) à chaque échantillon, ce RIN tient compte de l’intégralité de l’électrophérogramme ainsi que du rapport 28S/18S et reflète la qualité d’un ARN
(Schroeder et al., 2006). Sa valeur est comprise entre 1 et 10, 10 étant la qualité maximale. Seuls des
ARN dont le RIN est supérieur à 8.5 sont retenus pour réaliser les puces « Affymetrix ».
ii. Puces « Affymetrix »
Jour 1 - Amplification, transcription inverse et transcription in vitro
La préparation et la lecture de ces puces se déroulent sur 4 jours strictement selon les instructions du
fournisseur et sont présentées en figure 45. Le premier jour, suivant les instructions du kit Ambion
WT expression kit (4411973 10 rxn), 250 ng d’ARN sont prélevés et mélangés avec de l’ARN poly-A destiné à améliorer l’efficacité des réactions successives mises en œuvre avant d’hybrider les
échantillons sur les puces « Affymetrix ». Un ARN contrôle (Affymetrix GeneChip Poly-A control kit
#900433) est soumis aux mêmes réactions successives d’amplification et de purification. Il sert de contrôle interne à l’expérience. Les tubes « ARN totaux » et « ARN contrôle » sont traités de la même façon. Ils sont d’abord utilisés pour synthétiser le premier brin d’ADNc dans un thermocycleur pendant 2 heures. Puis le second brin est synthétisé (2 heures). Ces 2 brins sont ensuite
rétrotranscrits in vitro en ARNc à 40°C pendant 16 heures.
Jour 2 - Purification, transcription inverse
Le deuxième jour cet ARNc subit une première étape de purification sur billes magnétiques : ces billes captent les acides nucléiques et les immobilisent. Un aimant est ensuite utilisé pour les maintenir contre la paroi du tube où se déroule la réaction, le milieu est retiré à l’aide d’une pipette, remplacé deux fois par une solution de rinçage puis par une solution d’élution dans laquelle se libèrent les ARNc. Les billes sont alors retirées à l’aide de l’aimant. 10 µg de ces ARNc sont soumis à un second cycle de synthèse d’ADNc (environ 2 heures) puis les échantillons sont traités à l’aide d’une RNAse afin d’éliminer les matrices et congelés durant une nuit à -20°C.
Jour 3 - Purification, fragmentation, marquage biotine, hybridation
Le troisième jour, les ADNc sont purifiés sur billes magnétiques (voir « jour 2 »). À l’aide du kit
Affymetrix GeneChip WT Terminal Labeling Kit (PN 900671), 5.5 µg d’ADNc sont ensuite soumis pendant une heure à l’action d’une enzyme chargée de les fragmenter pour former des séquences courtes destinées à être hybridées sur les puces. Ces séquences sont ensuite couplées à de la biotine (1 heure). Un mélange d’hybridation est préparé à partir des ADNc marqués, d’ARN eucaryote servant de contrôle interne à l’expérience et de tampons et 80 µl sont déposés sur la puce (Affymetrix 901173). Le mélange est injecté sur la puce à travers un septum d’injection dans une chambre dont l’une des parois est couverte par les sondes. Le perçage préalable du septum
d’aération permet d’évacuer l’air de la chambre à mesure qu’elle se remplit avec le mélange d’hybridation. Toutefois, une bulle d’air est maintenue dans la chambre. Elle sert à homogénéiser la solution d’hybridation et à assurer que cette solution circule sur toute la surface de la puce couverte par les sondes. L’hybridation se déroule pendant 17 heures sous agitation à 45°C.
Jour 4 - Rinçages, marquage fluorescent, lecture
Le quatrième jour, les puces sont rincées, marquées à l’aide d’un complexe streptavidine (forte affinité pour la biotine) – phycoérythrine (permettant l’émission de fluorescence) et à nouveau
rincées dans les stations dédiées Affymetrix (GeneChip Fluidics Station 450) à l’aide du kit Affymetrix
900720. La fluorescence est mesurée à 570 nm par un scanner qui génère une cartographie d’intensité en nuances de gris. Un traitement informatique permet ensuite de faire le lien entre cette cartographie d’intensité et la liste des sondes présentes sur la puce et interrogées au sein de chaque échantillon, quantifiant ainsi les niveaux d’expression pour chaque gène.
Analyse bioinformatique - AMEN
L’analyse des données brutes générées par la lecture des puces requiert la maitrise d’outils bioinformatiques. Elle a donc été réalisée en collaboration avec Frédéric Chalmel, chargé de recherche au sein de l’équipe. Il a en effet développé un logiciel de traitement de données nommé
« Annotation, Mapping, Expression and Network » (AMEN) (Chalmel & Primig, 2008). Ce logiciel
permet de traiter et normaliser les données brutes générées (fichiers .cel) à la lecture des puces par le scanner Affymetrix, puis de réaliser les différentes filtrations statistiques qui conduisent à l’identification des gènes dont l’expression est significativement modifiée entre les échantillons de référence et les autres et de grouper les gènes selon leurs profils d’expression. Le logiciel intègre également les annotations des gènes disponibles dans les banques de données publiques telles que Gene Ontology (GO, processus biologiques) ou encore Comparative Toxicogenomics Database (CTD, impact des produits chimiques). Ceci permet de réaliser des analyses fonctionnelles permettant de dégager des tendances significatives, à savoir des enrichissements sur la base de ces annotations, au sein des lots de gènes obtenus. Concrètement, un enrichissement de la fonction « apoptose » signifie que, parmi tous les gènes dont l’expression est modifiée, la proportion des gènes impliqués dans ce processus est plus importante que la proportion attendue si les gènes impactés étaient pris au hasard.
6. HISTOLOGIE
La fixation permet d’éviter la lyse cellulaire après prélèvement, tout en préservant la structure de l’organe et les macromolécules. Elle conserve les antigènes nécessaires pour un traitement immunohistochimique et peut aussi augmenter la rigidité du tissu pour faciliter sa coupe.