Plan de la thèse et objectif général

Dans le document Évolution de la dépendance et homéostasie oxydative dans les symbioses insecte / Wolbachia (Page 36-53)

III.4. Plan de la thèse et objectif général

Mon travail de thèse est consacré à l’évolution de ces deux formes de dépendance à

Wolbachia, celle d’Asobara tabida (chapitres 1 à 3), et celle d’Asobara japonica (chapitre 4).

Dans le premier chapitre, un aspect crucial du scénario d’évolution de la dépendance d’A. tabida est testé. Il s’agit de la possibilité pour un hôte de réduire le coût d’une infection par Wolbachia en modulant son homéostasie oxydative. La manipulation expérimentale de l’homéostasie oxydative a été réalisée sur le modèle Drosophila melanogaster / Wolbachia. Recourir à cette association facultative, plutôt qu’au modèle A. tabida / Wolbachia, permet de comparer des lignées partageant un même fond nucléaire, mais des statuts d’infection différents. Dans le chapitre 2, je m’intéresse à l’impact de l’homéostasie oxydative sur la symbiose A. japonica /

wAjap, un modèle très proche d’A. tabida / wAtab3 mais où l’hôte a gardé le contrôle de son

ovogenèse. Dans le chapitre 3, je décris les approches mises en œuvre afin de clarifier les bases fonctionnelles de la dépendance d’A. tabida. L’étude transcriptomique d’ovaires infectés ou non par Wolbachia nous a permis de comparer l’effet de cette dernière chez A. japonica – où elle n’est pas requise pour l’ovogenèse – et chez A. tabida – où elle l’est. Enfin, le chapitre 4 est consacré à la perte des fonctions sexuelles d’A. japonica et aux approches transcriptomiques et d’écologie chimique destinées à étudier les conséquences de l’infection par Wolbachia chez

cette espèce. Dans cette optique, les transcriptomes et les profils d’hydrocarbures cuticulaires de femelles infectées ou non par Wolbachia ont été comparés afin d’identifier des gènes ou des composés potentiellement impliqués dans la perte de la reproduction sexuée.

Chapitre 1 : Rôle de l’homéostasie oxydative dans la

symbiose Drosophila melanogaster / Wolbachia

a) L’homéostasie oxydative

Les molécules pro-oxydantes dérivées de l’oxygène sont regroupées sous l’appellation de ROS (Reactive Oxygen Species). La majorité des ROS présents dans les cellules eucaryotes sont produits au cours de la réaction de phosphorylation oxydative dans les mitochondries (Balaban et al 2005). L'anion superoxyde (O2

•-) est considéré comme le ROS « primaire » car il est directement produit par la phosphorylation oxydative. Il peut interagir avec d'autres molécules, générant ainsi des ROS « secondaires », tels que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (OH) (Valko et al. 2006). Du fait de leurs propriétés réactives, les ROS peuvent engendrer des dommages au niveau de divers composants cellulaires (ADN, protéines, lipides). Cependant, ils ne sont pas uniquement des déchets du métabolisme aérobie, mais également des acteurs importants de la biologie de la cellule jouant un rôle dans la signalisation, la division, la différenciation et l’apoptose (Dröge 2002 ; Finkel 2011 ; Ray et al. 2012 ; Valko et al. 2006 ; figure 1.1). Notamment du fait de leur toxicité, les ROS sont également impliqués dans l’élimination des microbes et la réponse immunitaire d’une façon générale (Nathan & Cunningham-Bussel 2013). Environ 10 % des ROS présents dans les cellules animales sont produits de façon contrôlée par les protéines des familles NOX (NADPH oxidase) et DUOX (dual oxidase) (Monaghan et al. 2009). Les protéines NOX et DUOX sont des protéines membranaires qui facilitent le transfert d’électrons à travers les membranes plasmiques, ce qui conduit généralement à la formation d’un anion superoxyde, l’électron étant capté par une molécule d’O2 (Guichard et al. 2006).

L’homéostasie oxydative est la résultante de la production et de la dégradation des ROS, cette dernière étant fonction de la présence d’antioxydants. Parmi ces derniers, on distingue les antioxydants enzymatiques – tels que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et les glutathions péroxydases (Valko et al. 2006) – des antioxydants non enzymatiques, d’origine environnementale (vitamine C, glutathion).

Figure 1.1. Origine et effets pléiotropes des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) et de l’azote (RNS). L’anion superoxyde (O2•-) est engendré par la chaîne respiratoire mitochondriale et par les NOX et les DUOX. O2•- est converti en peroxyde d’hydrogène (H2O2) par la superoxyde dismutase. H2O2 peut réagir avec Fe2+ pour produire un radical hydroxyle (OH) via la réaction de Fenton. L’oxyde nitrique (NO) est synthétisé à partir de L-arginine par l’action des oxyde nitrique synthases. NO peut réagir avec O2•- pour produire du peroxynitrite (OONO-). Les ROS (O2•-, H2O2, OH) et les RNS (NO, OONO-) modulent de nombreux processus cellulaires (Monnin et al. 2014).

b) Homéostasie oxydative et traits d’histoire de vie

L’homéostasie oxydative est souvent considérée comme un facteur clé dans l’expression des traits d’histoire de vie, qui permettrait de faire le lien entre mécanismes physiologiques d’une part et processus évolutifs d’autre part (Costantini 2014 ; Dowling & Simmons 2009 ; Monaghan et al. 2009). Les ROS pourraient en effet jouer un rôle majeur dans l’explication des compromis évolutifs (trade-offs) entre traits d’histoire de vie : ces corrélations négatives qui empêchent les êtres vivants de maximiser simultanément toutes les composantes de leur valeur sélective, contraignant ainsi leur évolution (Stearns 1992). Trois caractéristiques évoquées ci-dessus font des ROS des candidats de choix pour ce rôle :

(i) Ils sont délétères lorsqu’ils sont en excès, un état connu sous le nom de stress oxydatif. (ii) Ils sont (majoritairement, mais pas exclusivement) produits par le métabolisme mitochondrial, et par conséquent des déchets inévitables qui accompagnent la production d’ATP.

(iii) Ils remplissent des fonctions essentielles, notamment dans le domaine de la signalisation cellulaire et de l’immunité.

Les effets de la production de ROS sont par conséquent potentiellement antagonistes. Positifs, indirectement via la production d’ATP (bien que la relation entre production d’ATP et production de ROS ne soit pas forcément linéaire, ni même positive ; voir Speakman & Selman 2011) ou directement via la contribution à la réponse immunitaire (ou d’autres fonctions). Mais aussi négatifs, par le biais des dommages oxydatifs qu’ils engendrent.

Compte tenu de son rôle dans la communication cellulaire, l’immunité et les traits d’histoire de vie plus généralement, il n’est pas surprenant que l’homéostasie oxydative joue un rôle particulièrement important au sein des relations symbiotiques. Un article présenté en annexe (The oxidative environment: a mediator of interspecies communication that drives

symbiosis evolution ; Monnin, Moné & Kremer 2014) se propose de synthétiser les informations

disponibles concernant ce rôle. Différents processus typiquement symbiotiques (établissement, maintenance, évolution et rupture des associations) sont étudiés, au sein de diverses interactions, mutualistes ou parasitaires, à transmission horizontale ou verticale. Dans ce qui suit, je me focaliserai sur le rôle que peut jouer l’homéostasie oxydative dans la médiation des symbioses impliquant Wolbachia, et notamment dans la régulation de la population symbiotique.

c) Homéostasie oxydative et régulation de la population symbiotique

L’infection par des organismes intracellulaires, tels que Wolbachia, est susceptible de déclencher une réponse immunitaire de l’hôte qui inclura généralement la production de ROS. La réponse immunitaire des insectes a principalement été étudiée chez la drosophile (Péan & Dionne 2014) et inclut :

(i) une réponse systémique inductible qui se manifeste par la sécrétion de peptides antimicrobiens et d’autres protéines bactéricides dans l’hémolymphe via le corps gras.

(ii) une réponse épithéliale qui repose sur la production locale de peptides antimicrobiens et de ROS.

(iii) une réponse cellulaire, effectuée par les hémocytes, qui peut prendre la forme d’une coagulation et mélanisation du microbe – exposant celui-ci à des ROS –, d’une phagocytose, ou encore d’une encapsulation. Lors de la phagocytose, le phagosome est rendu inhospitalier par la production de ROS via les NADPH oxydases (ainsi que par la forte acidité, la production de dérivés réactifs de l’azote, etc.). La production d’anion superoxyde accompagne également l’encapsulation (Nappi et al. 1995).

De l’ubiquité des ROS dans la réponse immunitaire des insectes, on peut raisonnablement conclure que Wolbachia est susceptible d’être confrontée à des ROS. Le fait qu’elle ait conservé des gènes codant pour des antioxydants, tels que la superoxyde dismutase et la bactérioferritine, va dans ce sens (Brennan et al. 2008 ; Kremer et al. 2009a) et suggère que les deux partenaires symbiotiques sont susceptibles d’exercer une influence sur l’homéostasie oxydative au sein de l’hôte.

Il est intéressant de noter que c’est principalement dans les associations nouvellement formées que Wolbachia déclenche une réponse immunitaire (Zug & Hammerstein 2015b). Cette réponse semble donc être modérée par la coévolution entre les partenaires – peut-être parce que la réaction immunitaire est typiquement plus coûteuse que bénéfique pour l’hôte. Ainsi, chez le moustique Aedes polynesiensis, l’infection par la souche de Wolbachia naturelle n’est pas associée à une production de ROS accrue, contrairement à ce qui est observé lorsqu’une autre souche est injectée artificiellement (Andrews et al. 2012). Cependant, lorsque

Wolbachia est directement coûteuse pour son hôte (plutôt qu’indirectement, via la réponse

immunitaire qu’elle déclenche), par exemple en raison d’un taux de réplication excessif, un accroissement de la réponse immunitaire pourrait être sélectionné. Il est probable que cet

accroissement de la réponse immunitaire se manifeste notamment par la production de ROS. En raison de la pléiotropie des ROS, cette adaptation pourrait avoir divers effets secondaires sur la physiologie de l’hôte, y compris des effets fortement délétères en absence du symbiote. Ce scénario permettrait ainsi d’expliquer l’incapacité d’A. tabida à gérer son homéostasie oxydative en absence de Wolbachia, et donc sa dépendance à celle-ci.

d) Test du scénario d’évolution de la dépendance

L’article présenté ci-après a pour objectif le test d’un aspect crucial du scénario d’évolution de la dépendance. Il s’agit de déterminer expérimentalement si la réduction du coût de l’infection peut s’opérer via une modulation de l’homéostasie oxydative. Mesurer l’impact d’une manipulation expérimentale de l’homéostasie oxydative sur le coût de l’infection nécessite la comparaison de lignées d’hôtes partageant un même fond génétique nucléaire mais ayant des statuts d’infection distincts. Ceci étant impossible – du fait de la dépendance – chez

Asobara tabida, nous avons utilisé Drosophila melanogaster, chez qui l’infection par Wolbachia est facultative, pour réaliser cette étude.

Discussion 1 : L’homéostasie oxydative et les scénarios d’évolution

de la dépendance

a) Effet du statut d’infection sur l’expression de Duox

Dans cette étude, la relation entre l’homéostasie oxydative, la densité symbiotique, et les traits d’histoire de vie de l’hôte a été étudiée par le biais de manipulations expérimentales de l’environnement oxydatif. Ce travail ne visait donc pas à élucider les mécanismes réels de régulation de la population symbiotique, mais à les « mimer » afin d’en étudier les conséquences dans des conditions contrôlées. Cependant, une partie (absente de l’article) des résultats concernant l’expression de gènes pourraient avoir un intérêt de ce point de vue.

En effet, en plus de Hsp83 et Dorsal, le niveau d’expression de Duox – le gène codant pour la protéine DUOX – a été mesuré. Ces résultats indiquent que le niveau d’expression de

Duox est inférieur chez les drosophiles infectées par wMelPop relativement aux drosophiles

infectées par wMel (figure 1.2). Cette différence pourrait résulter de la densité bactérienne supérieure chez les drosophiles infectées par wMelPop. Il parait surprenant que l’intensité de la réponse immunitaire soit inversement proportionnelle à la densité symbiotique, mais cette possibilité ne peut être exclue à priori. On peut par exemple imaginer que les Wolbachia sont capables d’inhiber la production de ROS de leurs hôtes et sont d’autant plus efficaces qu’elles sont nombreuses. La densité plus élevée de wMelPop serait alors bien la cause de l’expression réduite de Duox. L’hypothèse alternative est que wMelPop, du fait de propriétés intrinsèques, indépendantes de sa densité, entraine une réponse immunitaire d’une intensité inférieure à celle causée par wMel. Sous cette hypothèse, on peut imaginer que la forte densité de wMelPop est une conséquence, et non une cause, de la production réduite de ROS (figure 1.3). L’hypothèse selon laquelle duox contribue à la réduction de la population symbiotique pourrait être testée par le biais d’une manipulation expérimentale de son expression. Quelle que soit l’interprétation que l’on donne à ces résultats, ils semblent confirmer que l’homéostasie oxydative – et notamment sa régulation par les gènes de l’hôte – joue un rôle dans la médiation des symbioses hôte / Wolbachia. Cela conforte l’hypothèse selon laquelle l’homéostasie oxydative a contribué à l’évolution de la dépendance d’A. tabida, mais ne permet pas de valider un scénario unique.

Figure 1.2. Effet du statut d’infection, de l’âge et du traitement oxydatif sur l’expression de Duox (moyenne ± erreur standard) chez Drosophila melanogaster (2j : drosophiles âgées de 2 jours, 8j : drosophiles âgées de 8 jours, Mel : drosophiles infectées par wMel, Pop : drosophiles infectées par wMelPop). L’interaction lignée*traitement*âge est significative (F2,84=4,2 ; p=0,018). La méthode des contrastes a été employée pour réaliser les comparaisons deux à deux permettant de déterminer les effets du statut d’infection (wMel vs.

wMelPop) et des traitements (glutathion vs. témoin et paraquat vs. témoin). Sous chaque barre horizontale sont

indiquées les statistiques correspondant à l’effet du statut d’infection (pour chaque modalité de traitement, indiquée par la couleur). Les statistiques correspondant aux effets des traitements sont également indiqués, mais seulement lorsque ceux-ci sont significatifs au seuil α = 0,05.

Figure 1.3. Relations hypothétiques entre la densité de Wolbachia et l’expression de Duox.

b) Evolution du scénario d’évolution de la dépendance

Le scénario mis en avant dans l’article qui précède diffère de celui qui avait été proposé initialement (Kremer et al. 2010 ; Monnin et al. 2014). Ce dernier reposait sur trois points : (i) Dans les associations arthropodes / Wolbachia, la réduction du coût de l’infection se fera plutôt par une stratégie de tolérance (au sens strict) plutôt qu’une stratégie de résistance. La perte de Wolbachia peut en effet être contre-sélectionnée si celle-ci induit de l’incompatibilité cytoplasmique ou a un effet positif sur la valeur sélective de son hôte (e.g., par le biais d’une protection contre des ennemis naturels).

(ii) Wolbachia est susceptible de perturber l’homéostasie oxydative de son hôte (Brennan et al. 2008, Pan et al. 2012). En conséquence, la réduction du coût de l’infection par évolution de la tolérance pourra s’effectuer via une adaptation ciblant l’homéostasie oxydative.

(iii) Compte tenu de la pléiotropie des ROS, une stratégie de régulation alternative de l’homéostasie oxydative pourra se révéler optimale en présence du symbiote mais délétère en son absence. Dans un cas extrême, cela se traduirait par la dépendance totale de l’hôte à son symbiote.

C’est au niveau du point (ii) que le scénario présenté dans l’article précédent diffère de son ancêtre. Le nouveau scénario ne nécessite pas que Wolbachia induise une perturbation de l’homéostasie oxydative. Ce qui est important, c’est que la réduction du coût de l’infection s’effectue via une adaptation ciblant l’homéostasie oxydative. Or, pour que cela soit le cas, il n’est pas nécessaire que le coût lui-même soit dû à une perturbation de l’homéostasie oxydative. Compte tenu du rôle des ROS dans la réponse immunitaire, une modulation de l’homéostasie oxydative peut réduire le coût de l’infection – s’il s’agit d’un coût direct du symbiote – via une

réduction de la densité. Comme expliqué dans l’article, ce mécanisme de réduction du coût constitue un cas de tolérance au sens large.

Les scénarios potentiellement capables d’expliquer la dépendance d’A. tabida ne se limitent toutefois pas à des variations sur le thème de l’évolution de la tolérance. En effet, on ne peut pas exclure que la dépendance résulte d’une coévolution antagoniste entre Wolbachia et son hôte.

c) Courses aux armements et dépendance

Les courses aux armements peuvent mener à l’évolution de traits phénotypiques « extrêmes », qui ne sont adaptatifs que dans le contexte d’une interaction biotique particulière. Darwin (1862) proposait un tel scénario pour expliquer l’élongation de l’éperon nectarifère de l’étoile de Madagascar (Angraecum sesquipedale). Il prédisait l’existence d’un papillon (découvert par la suite et baptisé Xanthopan morgani praedicta) – doté d’un proboscis de grande taille – avec lequel l’orchidée avait coévolué. D’après Darwin, ces phénotypes extrêmes résultent d’une course aux armements entre les deux partenaires, la plante étant sélectionnée pour augmenter la longueur de son éperon, le papillon pour augmenter la longueur de son proboscis (« it would appear that there has been a race in gaining length between the nectary

of the Angræcum and the proboscis of certain moths »). Comme le remarquait Darwin, l’issue

de cette course aux armements est la dépendance d’Angraecum sesquipedale à Xanthopan

morgani praedicta pour la pollinisation (« The pollinia would not be withdrawn until some huge moth, with a wonderfully long proboscis, tried to drain the last drop. If such great moths were to become extinct in Madagascar, assuredly the Angræcum would become extinct. »). Une telle

course aux armements est-elle possible dans le cadre d’une symbiose insecte / Wolbachia ? Pourrait-elle expliquer la dépendance d’Asobara tabida ?

d) Conflits et niveaux de sélection

On peut s’attendre à ce que les conflits hôte / Wolbachia concernant la densité symbiotique soient très limités, mais seulement à condition (i) que le coût de Wolbachia soit principalement dû à sa présence dans les tissus somatiques (e.g., la tête dans le cas de

wMelPop), (ii) que la valeur sélective de Wolbachia dépende uniquement de sa présence dans

les ovaires et (iii) que la densité bactérienne somatique puisse être régulée indépendamment de la densité bactérienne ovarienne. On ne peut donc pas exclure qu’un conflit subsiste, notamment

dans le cas où les Wolbachia résidant dans les ovaires ont un impact important sur l’expression des traits d’histoire de vie de l’hôte et / ou que les Wolbachia résidant dans les tissus somatiques de l’hôte contribuent à la manipulation de la reproduction et / ou à la transmission (par exemple si la colonisation des ovaires se fait secondairement via des réservoirs somatiques ; Landmann et al. 2012 ; Sicard et al. 2014). De plus, cette vision des conflits hôte / Wolbachia reste incomplète car elle repose implicitement sur l’hypothèse selon laquelle la population symbiotique est une entité homogène, i.e., qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts entre bactéries au sein d’un même hôte. La découverte récente d’un polymorphisme au sein de la souche

wMelPop va à l’encontre de cette hypothèse.

Chrostek et Teixeira (2015) ont en effet montré que le nombre de copies d’une région génomique nommée octomom est très variable, et positivement corrélé avec le taux de réplication et la virulence de la souche wMelPop. Ces caractéristiques suggèrent qu’une certaine variabilité héritable, et associée à des différences de valeurs sélectives de la bactérie, pourrait exister au sein des populations symbiotiques, et ce malgré la transmission uniparentale. Par conséquent, un processus de sélection intra-hôte pourrait avoir lieu, favorisant un fort taux de réplication, et amplifiant le conflit d’intérêt entre les symbiotes et leur hôte. En effet, au sein des populations d’hôtes, la sélection inter-hôte devrait favoriser des variants de wMelPop relativement peu virulents : les femelles infectées par des bactéries dont la réplication est particulièrement explosive auront une faible valeur sélective. A l’inverse, au sein d’un hôte, la sélection intra-hôte pourra favoriser les bactéries se réplicant le plus rapidement, car elles appartiendront – toutes choses étant égales par ailleurs – aux variants ayant le plus de chances de se transmettre à la descendance. Le goulot d’étranglement subi par la population symbiotique à chaque génération de son hôte devrait tendre à l’homogénéiser. La sélection intra-hôte ne constituera donc une force évolutive importante qu’à la condition que le taux de mutation (i.e., de duplication de la région octomom) soit suffisamment important pour éviter cette homogénéisation.

Au final, on peut donc distinguer trois scénarios d’évolution de la dépendance d’A. tabida : le scénario « densité », défendu par Monnin et al. (2016), le scénario « tolérance

stricto sensu », proposé initialement par Kremer et al. (2010), et le scénario « course aux

Figure 1.4. Scénarios d’évolution de la dépendance d’A. tabida. (a) Scénario « densité » : du fait de sa forte densité, Wolbachia est coûteuse pour son hôte (1). Ce dernier réduit ce coût par le biais d’une modulation de son homéostasie oxydative (2) qui diminue la densité symbiotique (3). (b) Scénario « tolérance stricto sensu » :

Wolbachia perturbe l’homéostasie oxydative de son hôte (1), entrainant un coût chez ce dernier (2), qui réduit

ce coût en rétablissant une homéostasie oxydative optimale (3). (c) Scénario « course aux armements » : les étapes (1), (2) et (3) sont identiques à celles du scénario « densité ». La seule différence est que l’adaptation de l’hôte se fait au détriment de Wolbachia, ce qui sélectionne des bactéries capables de rétablir une densité optimale (4), conduisant à une nouvelle adaptation de l’hôte, et ainsi de suite.

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