5. Importance des membranes et du PI(4,5)P2 dans le processus mitotique
5.3. Le PI(4,5)P2 contribue à la dynamique de l’anneau contractile
Le PI(4,5)P2 constitue le phosphoinositide majeur de la membrane plasmique. De nombreuses études soulignent le rôle critique du PI(4,5)P2 dans la stabilité du sillon de clivage et la cytokinèse [159], [161]. La séquestration du PI(4,5)P2 par un domaine protéique spécifique de ce phospholipide, ou le traitement par un inhibiteur des PLC tel que le lithium ou le U73122, entraînent une régression du sillon de clivage suggérant que le PI(4,5)P2 et son hydrolyse sont nécessaires à la dynamique de l’anneau d’Actomyosine [163], [161]. Des protéines contrôlant la dynamique de l’Actine et nécessaires à l’ingression du sillon de clivage, telles que la Profiline, Diaphanous ou encore la Cofiline [9], [164], [165], présentent un changement d’activité et/ou de localisation suite à la liaison au PI(4,5)P2. Le PI(4,5)P2 est de plus capable (i) d’activer les protéines WASp et le complexe protéique ARP2/3 (figure 34), et (ii) de décaper les filaments d’Actine permettant l’ajout de nouveaux monomères d’Actine [166], [167] (cf. 212) (figure 34).
Des études réalisées chez la levure montrent que le PI(4,5)P2 contribue également à enrichir Rho aux sites de division [168]. En plus de réguler directement la dynamique de l’Actine, le PI(4,5)P2 la régule aussi indirectement via la production de diacylglycérol (DAG) et d’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) suite à son hydrolyse par les phospholipases C (figure 34). En se fixant sur les récepteurs calciques du réticulum endoplasmique, l’IP3 provoque la libération d’ions calcium favorisant l’activation de la Gelsoline [169] et de la Cofiline [170] par la Calmoduline (figure 34), conduisant au clivage et à la dépolymérisation des filaments d’Actine (cf. 212). L’activation de la Calmoduline conduit aussi à celle de la MLCK (Myosin regulatory Light Chain Kinase), qui active par
Figure 34 : régulation du cytosquelette d’actine par le PI(4,5)P2.
Les flèches noires symbolisent des stimulations (directes ou indirectes) et les lignes suivies d’une barre des inhibitions.
D’après Logan & Mandato, 2006.
phosphorylation la MLC [171] (figure 34) (cf. 213). Le PI(4,5)P2 est donc nécessaire à la stabilité et à l’ingression du sillon de clivage, grâce à sa capacité à moduler la dynamique de l’anneau d’Actomyosine à l’équateur.
En conclusion, le PI(4,5)P2 est connu pour jouer un rôle à l’équateur de la cellule en mitose en promouvant la contraction de l’anneau d’actomyosine. Il est cependant possible que ce phospholipide remplisse des fonctions additionnelles au cours de la division cellulaire, qui restent à identifier et caractériser. Les mécanismes qui régulent la synthèse et la distribution du PI(4,5)P2 durant la division cellulaire restent eux aussi à explorer.
Objectifs et stratégies expérimentales des travaux
L’ensemble des données disponibles au démarrage de ce travail suggérait une interaction fonctionnelle entre d’une part la régulation de la composition locale de la membrane plasmique par le PI(4,5)P2, et d’autre part la régulation de son lien avec les microfilaments d’Actine sous-jacents par les protéines ERMs, pour la réorganisation du cortex cellulaire.
Rappelons en effet que le PI(4,5)P2 favorise l’activation des ERMs, au moins in vitro. De plus, la dMoésine et le PI(4,5)P2 sont tous deux nécessaires au déroulement de la division cellulaire, même si leurs rôles respectifs ne sont pas pleinement caractérisés. Enfin, la relative simplicité du génome de la drosophile peut faciliter les approches fonctionnelles, notamment dans le cas des protéines ERMs. La question principale à laquelle je me suis
attachée a donc été de mieux comprendre le rôle du PI(4,5)P2 à travers les différentes étapes de la mitose, et de tester son éventuelle implication dans la régulation de l’activité de la dMoésine.
La stratégie générale a été de privilégier la qualité des observations, et notamment
l’utilisation systématique d’imagerie du vivant, pour accéder à la dynamique temporelle de la localisation subcellulaire des différents acteurs analysés. Les cellules de drosophile sont bien adaptées à la réalisation de crible fonctionnels, faciles à manipuler et notamment sensibles à l’interférence ARN pour inhiber l’expression de gènes par traitement dsRNA. L’autre dimension a donc été la recherche d’une certaine exhaustivité, en analysant l’influence de l’ensemble des régulateurs présumés de la biosynthèse du PI(4,5)P2 et des phosphatases PP1 et PP2 de la drosophile.
Une première étude à laquelle j’ai contribué a voulu définir, in vivo, les
la dMoésine. La stratégie retenue a été de substituer à la protéine endogène des formes mutées, pour prévenir la fixation au PI(4,5)P2, la phosphorylation, ou au contraire mimer cette phosphorylation, séparément et en combinaison. Pour ma part, je me suis attachée à analyser l’effet de ces différentes mutations sur la distribution subcellulaire de la dMoésine dans des cellules en culture, en interphase. Le résultat majeur de ces études étant la prévalence de la capacité de fixation au PI(4,5)P2, autant pour la fonction in vivo que pour la localisation cellulaire de la dMoésine, il m’a encouragé pour analyser en détail cette interaction au cours de la mitose.
Mon approche a été ensuite de générer un ensemble de lignées cellulaires,
exprimant de manière stable différentes protéines en fusion avec une moitié fluorescente, pour analyser, sur cellules vivantes, la dynamique de leur distribution dans des conditions contrôles ou suite à la déplétion d’un gène donné. Doté de cette batterie d’outils, couplée au développement d’approches d’imagerie adaptées, j’ai ensuite analysé de manière systématique l’influence de la déplétion d’une cinquantaine d’enzymes sur le déroulement général et la dynamique de la mitose.
La deuxième étude s’est attachée à mieux définir le rôle de la dMoésine, et de son
activation localisée aux différentes étapes du cycle cellulaire. Des résultats préliminaires montraient l’existence d’activité(s) phosphatase(s) contrecarrant l’activation (par phosphorylation) de la Moésine, que j’ai voulu identifier et caractériser. D’autre part, j’ai développé des outils originaux et/ou complémentaires pour bien définir le rôle du PI(4,5)P2 en mitose et son influence sur l’activité et la distribution de la dMoésine au cortex mitotique. Mes résultats positifs m’ont conduit à analyser le rôle éventuel de l’ensemble des enzymes susceptibles de participer à l’homéostasie du PI(4,5)P2 au cours de la mitose, en me focalisant d’abord sur l’organisation du cortex cellulaire. Ensemble, mes travaux produisent une vision « intégrée » du contrôle de la production du PI(4,5)P2 dans les cellules de drosophile en division et leur influence, en dialogue avec le contrôle de la (dé)phosphorylation de la dMoésine, sur l’organisation du cortex mitotique.
Ma contribution à la troisième étude a été d’utiliser les mêmes approches, crible fonctionnel exhaustif basé sur l’imagerie du vivant, pour rechercher parmi les enzymes du métabolisme des phosphoinositides ceux dont la déplétion empêche la division cellulaire. A noter, cette version du manuscrit de thèse est délétée de ma discussion relative à cette troisième étude, selon les exigeances de Sébastien Carréno et de Khaled Ben El Kadhi. Ce travail a permis d’identifier un « nouveau » régulateur de la distribution du PI(4,5)P2 sur les membranes intracellulaires versus membrane plasmique, et de montrer son rôle clé dans la mise en place et la fonctionnalité du sillon de clivage.