La sénescence est un processus développemental, contrôlé par l’âge, qui se termine par la mort cellulaire. En fin de sénescence dans une cellule du mesophylle, les gérontoplastes sont peu nombreux et la plupart des membranes sont abimées par l’action délétère des ROS qui s’autoalimentent. Chez certaines espèces comme c’est le cas chez le colza, les dernières étapes menant à la mort cellulaire sont parfois interrompues par l’abscission de la feuille. Mais lorsque cette étape se déroule jusqu’à son terme, les mitochondries, les parois et les noyaux sont partiellement ou totalement dégradés (Thompson et al., 2000; Noodén, 2004). La PCD (Programmed Cell Death) est un processus d’autodestruction cellulaire très finement contrôlé au niveau génétique. Lors de la sénescence, la vitesse de mort cellulaire est plus lente que lors d’autres types de PCD où il n’y a pas nécessairement de remobilisation de métabolites (lors de la réponse de type hypersensible (HR, hypersensitive
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reaction) en résistance à des pathogènes par exemple)(van Doorn, 2005). Cependant, la mort cellulaire lors des derniers stades de la sénescence présente tout de même des traits caractéristiques de la PCD comme la destruction contrôlée de la vacuole, la condensation de la chromatine et la destruction de l’ADN. Il semble qu’au sein de la feuille les différents types cellulaires ne meurent pas en même temps et que les cellules épidermiques restent plus longtemps actives que celles du mésophylle (Keech, 2011). Une comparaison de l’expression globale des gènes lors de la mort cellulaire naturelle et celle provoquée par une carence nutritive a été réalisée à partir de suspensions cellulaire d’Arabidospis (Buchanan-Wollaston et al., 2005). Cette étude a mis en évidence des voies différentes menant à la mort cellulaire dans les deux cas, prouvant que bien que proches, la PCD provoquée par la sénescence naturelle et celle induite par un stress étaient différentes.
L’apoplaste est un compartiment largement sollicité lors des étapes de la sénescence. En effet, en plus de contenir la paroi qui structure les cellules, l’apoplaste est impliqué dans la reconnaissance des signaux (notamment hormonaux), la remobilisation des nutriments et l’induction de la mort cellulaire. L’apoplaste est constitué d’une matrice protéique fluide appelée fluide apoplastique, formant un compartiment continu extracellulaire qui permet une communication de cellule à cellule (Sattelmacher, 2001). Delannoy et al, (2008) ont listé 46 protéases présentes dans l’apoplaste des feuilles d’Arabidopsis parmi lesquels 8 seraient surexprimées durant la sénescence. De plus, les transporteurs de la membrane plasmique sont surexprimés pendant la sénescence (van der Graaff et al., 2006) ce qui laisse supposer un important mouvement de molécules entre le cytosol et l’apolaste. Des études chez le tabac ont mis en évidence des changements de composition du protéome du fluide apoplastique en réponse à un stress salin. Ainsi une accumulation de chitinases et de protéines associées au transport lipidique dans l’apoplaste a été démontrée (Dani et al., 2005). Ces enzymes font aussi partie de celles surexprimées pendant la sénescence (Yoshida et al., 2001). D’autres enzymes présentes dans l’apoplaste comme la lipase Glip1 impliquée dans la réponse à une infection fongique (Oh et al., 2005) présentent une surexpression de leur gène pendant la sénescence (Winter et al., 2007).
Le rôle de l’apoplaste dans le déclenchement de la PCD en réponse à une attaque de pathogène est documenté (Delannoy et al., 2008) cependant son rôle lors de la sénescence n’a pas encore été démontré. De manière générale, la PCD induite par les réactions hypersensibles (HR) lors d’une attaque de pathogène est mieux comprise que celle se produisant dans les derniers stades de la sénescence. Lors d’une attaque de pathogène, la PCD est induite notamment par un burst oxydatif dû à la dégradation de polyamines dans l’apoplaste (Takahashi and Kakehi, 2010) et la sécrétion de certaines molécules comme la cathepsine B (Gilroy et al., 2007). Cependant, ceci n’est pas prouvé dans le cas de la sénescence, bien que la dégradation des chlorophylles et des membranes génèrent une quantité importante de ROS. En plus de son rôle possible dans le déclenchement de la PCD, il a été démontré chez Arabidopsis que plusieurs enzymes dégradant les parois cellulaires (β-glucosidase) sont surexprimées lors de la diminution de la photosynthèse (Mohapatra et al., 2010), suggérant que la
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paroi cellulaire des cellules de la feuille est dégradée au cours de la sénescence. Ces auteurs ont suggéré que les polysaccharides liés à la paroi cellulaire peuvent être une source de sucres pendant la phase tardive de la sénescence.
3 Marqueurs de l’évaluation de la sénescence foliaire
La progression de la sénescence des feuilles est généralement évaluée par différents indicateurs physiologiques, biochimiques ou moléculaires tels que le jaunissement des feuilles, des changements de teneurs en chlorophylle et en protéines (Levey and Wingler, 2005), des changements d’expression de certains gènes (Gombert et al., 2006). L’utilisation selon les études de différents indicateurs, associés à des étapes différentes de la sénescence, rend la comparaison des résultats souvent compliquée.
3-1 Marqueurs physiologiques
Le jaunissement de la feuille étant la conséquence la plus remarquable de la sénescence, la quantité de chlorophylles est régulièrement utilisée comme marqueurs de l’avancement de la sénescence (Otegui et al., 2005; Zhang et al., 2012) bien que la précision de cet indicateur reste critiquable. Dans le cas de carences, ce paramètre est encore moins précis, ainsi Gombert et al., (2006) ont mis en évidence que deux feuilles de plantes cultivées sous différents régimes azotés présentaient une quantité de chlorophylles identique bien qu’elles soient d’âge très différent.
L’activité dépendante de la sénescence de certaines enzymes comme des peroxydase (Abeles et al., 1988) ou des RNAse (Taylor et al., 1993) peut aussi être utilisée pour mesurer la progression de la sénescence, cependant ces mesures sont lentes, destructives et peu précises.
La mort cellulaire en fin de sénescence s’accompagne de la dégradation de la membrane plasmique et du relargage d’ions qui peut être facilement mesuré (Woo et al., 2001) cependant cet indicateur très précis n’est utile qu’à la toute fin de la sénescence.
3-2 Marqueurs moléculaires
Le profil d’expression particulier (surexpression ou répression spécifiquement associées à la sénescence) de certains de ces gènes peut permettre un balisage précis des différentes phases de progression de la sénescence. Ainsi la surexpression du gène SAG12 (et SAG13) est régulièrement repérée dans les feuilles (Guiboileau et al., 2010). A l’inverse le gène Cab, codant une apoprotéine liée
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aux chlorophylles, est réprimé lors de la sénescence foliaire (Gombert et al., 2006), comme de nombreux gènes du métabolisme primaire. Ces gènes ont été proposés comme marqueurs pour identifier la transition source/puits dans une feuille sénescente.
4 Impact d’un stress abiotique sur la sénescence foliaire
Comme décrit précédemment, c’est durant la sénescence que se déroule la remobilisation dont l’efficacité détermine fortement le rendement final chez les plantes de grandes cultures. Les facteurs environnementaux contribuent largement à réguler l’initiation et la progression de la sénescence et les processus de recyclage des ressources. Les stress abiotiques, dépendamment de leur nature, leur amplitude, leur fréquence, leur durée, sont pour la plupart inducteurs de phénomènes de vieillissements accélérés des tissus qui peuvent s’apparenter au processus de sénescence
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4-1 Stress Hydrique
Un des rôles de l’eau au sein de la plante est le transport des solutés à longue distance dont le principal moteur est l’évapotranspiration. L’eau contribue également au maintien de la turgescence, à de nombreuses réactions chimiques, à la transmission de la chaleur… De manière générale, l’eau se déplace des racines vers les feuilles, ces échanges impliquent qu’un gradient de potentiels hydriques décroissants existe également des racines vers les organes aériens et l’air extérieur. Le cycle de l’eau au sein de la plante est majoritairement contrôlé au niveau de la feuille ou l’ouverture/fermeture des stomates permettent de maintenir le potentiel hydrique dans les lacunes. Le stress hydrique diminue fortement les rendements agronomiques et les prévisions climatiques suggèrent que les épisodes de sécheresse dans le monde seront de plus en plus fréquents (Cook et al., 2007).
La feuille est l’organe de la plante trésréactif aux conditions environnementales et sa structure joue un grand rôle dans les relations hydriques (Aasamaa et al., 2005). En utilisant la particularité nutritive de certains insectes qui ne se nourrissent que du contenu du parenchyme palissadique, Nardini et al. (2010) ont mis en évidence le fait que le contrôle des relations hydriques au sein des tissus foliaires se fait par le parenchyme lacuneux. Ils ont démontré que quel que soit la quantité de parenchyme palissadique détruite la résistance hydraulique ne changeait pas.
Différentes adaptations anatomiques, physiologiques, moléculaires sont susceptibles de contribuer à la résistance/tolérance au stress hydrique (Baerenfaller et al., 2012). Chez de nombreuses espèces adaptées à des climats très chauds, la cuticule foliaire est très épaisse afin de minimiser la transpiration non contrôlée, et le stress hydrique peut induire chez certaines plantes la modification de la composition et de la quantité de ces cuticules. Au niveau structural, une diminution de la taille des
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cellules du parenchyme lacuneux chez Phaseolus vulgaris a été décrite en réponse à un stress hydrique (Martinez et al., 2007) et la contraction des cellules est souvent associée à une meilleure tolérance au stress hydrique (Lecoeur et al., 1995). Cependant, une augmentation de la taille des cellules du parenchyme lacuneux a été observée dans la feuille d‘olivier cultivé en condition limitante en eau (Guerfel et al., 2009). Afin de maintenir la turgescence nécessaire au bon fonctionnement de la cellule un ajustement osmotique est nécessaire (Chimenti et al., 2012). Ainsi de nombreuses molécules sont produites, aussi bien des osmolytes permettant de faciliter l’entrée et la rétention de l’eau (Ingram and Bartels, 1996) que des molécules protectrices des macromolécules (Martínez et al., 2008). Parmi ces molécules, la proline est considérée comme un des osmoprotectants majeur (Naidu et al., 2000;
Szegletes et al., 2000), son accumulation permettant à la fois l’ajustement osmotique (Albert et al., 2012), la régulation du potentiel redox de la cellule et la détoxification des ROS. Le stress hydrique est, en effet, généralement générateur de ROS (Jaspers and Kangasjarvi, 2010; Miller et al., 2010) et différentes enzymes de détoxification sont nécessaires à leur contrôle. Un lien est établi entre les régulations mises en œuvre au cours de la sénescence foliaire et certaines réponses observées en réaction au stress hydrique. Il a notamment été montré chez le tabac, puis par la suite chez d’autres espèces, que la manipulation génétique du métabolisme des cytokinines pouvait non seulement contribuer à retarder l’avènement de la sénescence foliaire (effet « stay green ») mais contribuait également à renforcer la tolérance des plantes au stress hydrique (Munne-Bosch and Alegre, 2004).
4-2 Nutrition azotée : cas du colza
En phase de croissance végétative, la majeure partie de l’azote et des nutriments minéraux est concentrée dans les organes foliaires (Makino and Osmond, 1991; Schulze et al., 1994) . En dépit de sa bonne capacité à absorber l’azote minéral, le colza (Brassica napus L.) est caractérisé par une faible efficience d’usage de l’azote (NUE) et seulement 50% de l'azote absorbé par la plante est présent dans les graines à la récolte (Schjoerring et al., 1995). Alors qu’il faut globalement 6,5 Kg d’azote pour produire un quintal de graines de colza, 3 et 2,2 Kg sont nécessaires pour produire l’équivalent de blé et de tournesol respectivement (Singh, 2005). Une grande partie de l’azote stocké dans la graine de colza sous forme de protéines provient de processus de remobilisation de l’azote organique des parties végétatives (Malagoli et al., 2005). Tout au long du cycle végétatif puis reproducteur de la plante, les organes foliaires sénescent puis chutent avec des teneurs résiduelles en azote organique qui restent parfois élevées (jusqu’à 3% de la matière sèche (Rossato et al., 2001)). L’amélioration de la NUE du colza est nécessaire pour concilier impact environnemental réduit, objectif de haut rendement en qualité et quantité et bilan énergétique optimisé. Fonctionnellement, la NUE (Figure 9) peut être subdivisée en deux grandes composantes: efficacité d'absorption de l’N (NUpE) et l’efficacité d'utilisation de l’N (NUtE). Cette dernière composante complexe intégre les processus d’assimilation (NAE), de stockage et de recyclage ou de remobilisation de N (NRE). Plusieurs études menées en
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conditions contrôlées ou sur le terrain (Malagoli et al., 2005; Tilsner et al., 2005; Gombert et al., 2006) ont démontré que que la faible NUE observée pour le colza est en partie attribuable à une NRE modérée. L’élaboration du rendement final en grain est largement dépendante de la mise en place du couvert végétal et de la biomasse végétative. La sénescence séquentielle mise en œuvre au cours de cette phase contribue ainsi à ré-allouer des ressources entre les tissus végétatifs sources et les jeunes feuilles en croissance. Il a été montré que l'élimination de 50% de feuilles de la rosette donne lieu à une importante diminution (-30%) du rendement (Noquet et al., 2004). Les approches transcriptomiques ont révélé l'induction de nombreux transporteurs d’oligopeptides au cours de remobilisation de l’N dans les feuilles sénescentes de colza (Karim et al., 2005). Il semble que la faible NRE associée à la sénescence séquentielle pourrait ne pas être due à une limitation de l’export des acides aminés mais est principalement liée à une hydrolyse incomplète des protéines foliaires (Noiraud et al., 2003; Tilsner et al., 2005). En utilisant une technique de marquage 15N et l'élaboration d’un modèle mathématique de la remobilisation,, Malagoli et al. (2004) ont montré, par simulation, que la teneur en protéines ou le rendement en grain pouvait être améliorés d’environ 15% grâce à l'optimisation de la NRE pendant les stades végétatifs. Parallèlement, au cours de la dernière décennie, quelques études ont cherché à améliorer la NUE du colza via l'optimisation des caractéristiques de fonctionnement racinaire (NUpE) (Schulte auf’m Erley et al., 2007). Des approches transgéniques ont aussi démontré que l'amélioration de la NAE à travers la sur-activation d’enzymes impliquées dans le processus d'assimilation de l’N (alanine aminotransférase, l'asparagine aminotransférase) peut conduire à des améliorations tout à fait significatives de la NUE (Good and Beatty, 2011). Néanmoins, dans un contexte de réduction des intrants azotés, l'optimisation de la NRE par la feuille est probablement l'un des principaux leviers pour améliorer sensiblement la NUE du colza.
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Figure 8 : Schéma représentatif des flux d’azote et des différentes composantes de la NUE chez le colza (Avice and Etienne, 2014)
Un stress azoté, chez le colza, induit et accélère la sénescence des feuilles agées. En effet, certaines études réalisées aussi bien sous serre (Gombert et al., 2006; Etienne et al., 2007) qu’au champ (Gombert et al., 2010) ont montré que des plantes carencées en azote présentaient une sénescence précoce des feuilles les plus âgées qui contribuerait à prévenir ou limiter la pénurie dans les tissus les plus jeunes. Ces études ont permis de mettre en lumière le rôle des protéases et des inhibiteurs de protéases dans le contrôle de la sénescence, notamment en situation de nutrition azotée limitante. Notamment, la protéine BnD22 (Brassica napus Drought induced protein 22 kDa) exerçant à la fois un rôle d’inhibiteur de serine-protéase et une fonction de WSCP (Water Soluble Chlorophyll Protect) est plus abondante dans les tissus jeunes et d’autant plus que la plante est carencée en azote en lien étroit avec le ralentissement de la sénescence. Les WSCP sont des protéines se complexant avec les chlorophylles pour les protéger notamment lors de la sénescence (Horigome et al., 2007). Des études ont démontré que BnD22 et d'autres WSCPs sont accumulées dans les jeunes feuilles en réponse à divers stress abiotiques et pourraient contribuer à assurer une gestion optimisée des stocks d’azote organique disponibles dans les tissus en situation de contrainte (Satoh et al., 2001; Desclos et al., 2009).
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5 L’étude des végétaux par résonance magnétique nucléaire
La relaxomètrie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) à bas champ est une technique permettant de mesurer le signal de relaxation (retour à l’équilibre après excitation par une séquence d’impulsions magnétiques spécifiques) des spins des protons soumis à l’action d’un champ magnétique. Ce signal est fait de deux composantes : la composante longitudinale, ou relaxation spin-réseau T1, provoquée par l’interaction des spins avec l’environnement et la composante transversale, ou relaxation spin-spin T2, due à l’interaction entre les spins (figure 9). Les valeurs des temps de relaxation T1 et T2 et l’intensité du signal sont influencées respectivement par la mobilité et la quantité de protons. Le temps de relaxation sont également influencés par les échanges de protons entre les molécules.
Figure 9 : schéma représentatif des deux composantes de relaxation du signal RMN, la relaxtion spin-réseau (A) et la relaxatiuon spin-spin (B)
Le signal de relaxation T2 décroit comme une exponentielle dont l’intensité dépend de la quantité de protons dans le tube et la vitesse d’amortissement dépend du temps de relaxation. Dans les systèmes hydriques, le temps de relaxation de l’eau va dépendre de la composition de la phase aqueuse et de la structure des molécules contenues dans cette phase aqueuse, mais aussi de la microstructure de la matrice. Par exemple, dans un système binaire composé d’eau et de protéines, il est possible de distinguer quatre types de protons avec des temps de relaxation différents : les protons de l’eau dite
« libre » (sans interactions avec les protéines), les protons de l’eau d’hydratation des protéines, les protons échangeables des protéines (groupement -OH, -NH2, -SH...) et enfin les protons non échangeables des protéines (protons des chaines carbonées). Lorsque les temps de relaxation sont longs par rapport à la vitesse des échanges chimiques entre les différentes populations de protons échangeables, et si les échanges de molécules d’eau par diffusion entre l’eau « libre » et l’eau d’hydratation sont rapides, alors le signal de relaxation sera décrit par deux exponentielles différentes.
La première correspondra à la relaxation des protons non-échangeables des protéines et l’intensité de l’exponentielle sera proportionnelle à la quantité de protéine. La deuxième exponentielle sera
A B
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caractérisée par un temps de relaxation « moyen » qui sera la somme de différentes vitesses de relaxation 1/T2 pondérées par les proportions de chaque type de protons :
1/T2obs = Pa/T2a + Pb/T2b + Pc/T2c
avec P les populations des différents types de protons. a) : les protons de l’eau libre b) : les protons de l’eau d’hydratation des macromolécules et c) : les protons échangeables des macromolécules. L’intensité à l’origine de cette exponentielle sera donc proportionnelle à la quantité d’eau (libre et hydratation) et la quantité de protons échangeables des protéines.
Du fait de l’échange chimique entre les protons échangeables des protéines et les protons de l’eau, ceci entraine une forte diminution de la relaxation de l’eau sans nécessairement réduire la mobilité intrinsèque de la molécule d’eau. Ainsi, tout changement de mobilité de ces molécules non-aqueuses entrainera par voie de conséquence une diminution du temps de relaxation de l’eau. Ce mécanisme confère une propriété à l’eau d’être une sonde des changements de mobilité des molécules avec lesquelles l’eau interagit.
Les phénomènes décrits sont valables pour un milieu homogène, c'est-à-dire un milieu pour lequel les molécules d’eau peuvent sondées l’ensemble des environnements du fait d’un coefficient de diffusion élevé et donc d’une diffusion rapide. Par contre, si le milieu devient hétérogène de sorte que l’eau n’a pas le temps (ou la possibilité) de diffuser entre les différents environnements, alors le signal sera multi-exponentiel. Ceci est observé dans le cas de gel présentant des poches d’eau. Pour un tel système le signal de relaxation sera tri-exponentiel, avec une exponentielle pour les protons non-échangeables, une exponentielle pour la fraction d’eau dans le gel et une exponentielle pour la fraction d’eau contenue dans les poches d’eau.
Cette situation est classiquement observée dans les tissus végétaux. Les signaux de relaxation multi-exponentiels obtenus dans ce cas sont expliqués par les limites à la diffusion entre les différents compartiments hydriques et sont souvent attribuées aux différents compartiments de la cellule végétale (Hills et al., 1990; Ratcliffe, 1994). De plus, du fait de l’organisation et de la composition des différents compartiments les protons de l’eau de la paroi, des chloroplastes, de la vacuole... ne relaxent pas avec les mêmes temps de relaxation. Les mécanismes décrits précédemment affectent la relaxation T1 et T2, mais du fait de la plus grande sensibilité des T2 à la composition de chaque compartiment, ce dernier est plus souvent utilisé pour étudier les états hydriques des végétaux (Snaar and Van As, 1992).
Dans la plupart des tissus végétaux la composante du signal RMN ayant le T2 le plus long et l’amplitude la plus importante, est généralement associée à l’eau de la vacuole. En plus de la composition et de la nature des solutés, le T2 sera influencé par la taille de la vacuole et la perméabilité membranaire (Van As, 2007). Une grande vacuole favorisera des temps de relaxation élevés, tandis qu’une petite vacuole présentera des temps de relaxation faible. Tous les solutés n’influencent pas le
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signal de l’eau de la même manière; le T2 moyen de la feuille de blé est par exemple corrélé
signal de l’eau de la même manière; le T2 moyen de la feuille de blé est par exemple corrélé