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i. PCR conventionnelle (et électrophorèse)

Le principe de la réaction de polymérisation en chaine in vitro (Polymerase Chain Reaction, PCR)

repose sur les effets sur l’ADN des variations de température et la capacité de l’ADN à s’apparier spontanément grâce à la complémentarité des bases qui le composent. Il a été mis au point par

Mullis et al, (Mullis et al., 1986). Cependant la chaleur nécessaire à la dénaturation de l’ADN double

brin dénaturait également la polymérase bactérienne utilisée pour synthétiser les nouveaux brins. Ce problème fut résolu en 1988 quand l’enzyme bactérienne fut remplacée par une polymérase extraite

d’un micro-organisme hyperthermophile : Termophilus Aquaticus (Saiki et al., 1988). Celui-ci donne

son nom à l’enzyme encore utilisée aujourd’hui, la Taq polymérase. Des amorces -courtes séquences nucléotidiques- sont fabriquées de façon à ce que leurs séquences soit complémentaires des extrémités du fragment d’ADN que l’on souhaite étudier. La présence d’une amorce sur chaque brin (amorce « sens » et « antisens » ou « forward F » et « reverse R » en anglais) permet de délimiter de façon spécifique la zone d’intérêt. Ces amorces, présentées dans la figure 41 A, s’apparient donc aux extrémités du fragment d’intérêt et la Taq polymérase vient ensuite les prolonger par la synthèse d’un nouveau brin d’ADN.

L’ADN double brin est dénaturé pour permettre la fixation des amorces, les nouveaux brins sont synthétisés grâce à la complémentarité des bases puis l’ADN subit une nouvelle étape de dénaturation qui sépare les brins, les rendant aptes à recevoir une nouvelle fois des amorces. Ces cycles sont répétables un grand nombre de fois, mais plus il y a de cycles, plus les conditions de réaction deviennent défavorables et moins la synthèse est efficace. Le milieu de réaction est composé d’amorces (un mélange d’amorces F et R à 20 µM chacun), d’ADN matrice (1 µl de produit

Phase de génération de la courbe de dissociation : élévation progressive de la température 40 cycles 10 min 95°C 1 sec 1 min 50°C TH 95°C 60°C 15 sec 1 min Pente : -3.398 Efficacité : 96.932

Points de gamme : produit de PCR dilué Échantillon d’intérêt

B A

Lecture de la fluorescence

Figure 42 : PCR quantitative (qPCR)

Elle repose sur les mêmes principes que la PCR conventionnelle mais l’incorporation d’une molécule fluorescente permet de suivre en temps réel la formation de nouveaux brins d’ADN.

A : Représentation du cycle de qPCR. La température d’hybridation (TH) varie selon les amorces utilisées. Elle est la même qu’en PCR conventionnelle.

B : Gamme. La droite représente le CT en fonction de la concentration d’ADNc du gène d’intérêt (échelle logarithmique). Cette droite doit être linéaire sur 5 log et le CT des échantillons d’intérêt doit appartenir à la partie linéaire de la droite. L’efficacité de la qPCR doit être aux alentours de 100 % et

de la rétrotranscription de 250 ng dans 40 µl soit environ 6 ng), de désoxynucléotides libres pour former les nouveaux brins (0.6 µl d’un mélange à 10 mM), de Taq polymérase (0.6 U - Qiagen), d’un tampon de réaction (10 X PCR buffer Coral Load - Qiagen) assurant notamment la stabilité du pH du milieu et d’eau (qsp 25 µl). Le mélange réactionnel est ensuite placé dans un thermocycleur qui assure les variations de température (figure 41 B) : l’étape de dénaturation à 94°C sert à dissocier les molécules d’ADN double brin en rompant les liaisons hydrogène qui les maintiennent. C’est aussi le rôle de l’étape 2. La température s’abaisse ensuite pour atteindre la température d’hybridation des amorces sur la matrice (étape 3). Cette température est variable selon les amorces utilisées, elle dépend de leur composition en bases et est calculable selon la formule « [2 x (A+T) + 4 x (G+C)] – 2 ». Les 2 amorces d’un même couple doivent avoir une température d’hybridation similaire. L’étape 4 est dite de « polymérisation ». Elle a lieu à 72°C, la température optimale d’activité de la Taq polymérase. Chaque répétition des étapes 2-3-4 permet un doublement du nombre de copies du

fragment d’ADN d’intérêt dans le milieu de réaction. En fin d’amplification, une 5ème étape

d’élongation finale termine la réaction et l’ADN est refroidi pour permettre sa conservation (quelques heures à 10 °C, puis à -20°C).

La migration sur gel d’agarose est utilisée pour contrôler la qualité de la PCR. Un gel à 1.2 % est réalisé (dissolution à chaud de 0.6 g agarose dans 50 ml TAE 1X (figure 41 C) et 5 µl de Gel Red, un intercalant de l’ADN qui se fixe dessus et possède des propriétés de fluorescence sous ultra-violets permettant sa révélation). Le gel, une fois refroidi et solidifié, est immergé dans une cuve polarisée contenant du tampon TAE 1X. 10 µl de produit de PCR ou un marqueur de taille sont déposés dans des puits formés par un peigne placé dans le gel en surfusion et dont les dents laissent leur empreinte dans le gel solidifié. Un courant électrique circulant du pôle – vers le + fait migrer les fragments d’ADN sur le gel selon leur taille : les grands fragments, plus encombrants, sont ralentis par les mailles constituées par le gel alors que les petits migrent plus vite. À la fin de la migration, le gel est placé sous ultra-violet. Les bandes qui apparaissent sont les fragments d’ADN amplifié. Une seule bande indique la présence d’un seul produit d’amplification et la comparaison avec un marqueur de taille (mélange standardisé contenant des fragments d’ADN de différentes tailles connues) permet d’estimer la taille de ce produit.

ii. qPCR

La PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel (figure 42 A) suit le même principe que la PCR classique décrite plus haut : l’ADNc est dénaturé, les amorces s’hybrident de façon spécifique (à une température définie en PCR conventionnelle), un nouveau brin complémentaire est synthétisé. Mais la qPCR intègre la détection et la quantification d’une molécule dont la fluorescence est proportionnelle à la quantité d’amplicons générés à chaque cycle du processus d’amplification. En 1993, Higuchi décrit cette technique en utilisant comme molécule fluorescente le Bromure

d’éthidium (BET), un intercalant de l’ADN (Higuchi et al., 1993). Ici le BET est remplacé par un

fluorochrome de nouvelle génération, le Bryt Green (Promega), et la qPCR est réalisée sur un appareil Applied Biosystems 7500 Real-Time. La qPCR implique la notion de seuil défini comme étant

la valeur de fluorescence significativement supérieure à celle du bruit de fond, toujours obtenue lors de la phase exponentielle de l’amplification. Un cycle-seuil (ou Cycle Threshold, Ct) est alors déterminé et correspond au cycle de PCR au cours duquel la fluorescence émise dépasse le seuil. La fluorescence émise est proportionnelle au nombre de copies du gène d’intérêt présentes dans le milieu réactionnel. Les courbes de dissociation (ou « de fusion ») sont obtenues à la fin des 40 cycles par élévation progressive par palier de 0.5°C de la température entre la température d’hybridation et 95°C avec mesure de la fluorescence en continu : plus la température s’élève, plus les amplicons se dissocient en fonction de leur taille et composition en bases. Si la taille ou la composition varie, le pic de dissociation survient à une température différente, démontrant la détection de plusieurs amplicons. Ceci permet aussi de détecter tout ADN, y compris les dimères d’amorces (petit pic à moindre T°C qui apparait aussi dans les témoins négatifs sans matrice) ou une aspécificité d’amorces. Afin d’éviter l’amplification d’ADN génomique résiduel, les deux membres du couple d’amorces sont situés sur des exons différents. La taille de l’amplicon est également un facteur important. Elle se situe généralement entre 70 et 200 paires de bases. Les petites tailles sont privilégiées car la synthèse s’en trouve facilitée.

Une gamme-étalon (figure 42 B) est nécessaire pour évaluer l’efficacité de la réaction et le coefficient de corrélation entre le CT et la quantité d’ADN détectée. Elle est réalisée sur des produits de PCR

(préalablement dilués au 1/10000ème) dilués au 10ème en cascade. Le produit de PCR est généré par 38

cycles d’amplification en utilisant comme matrice l’ADNc d’un échantillon d’intérêt. L’efficacité est liée à la pente de la droite représentant le CT du gène d’intérêt en fonction de la quantité d’ADNc d’intérêt présent dans la matrice. En réalisant cette gamme, on ajoute un point pour lequel, au lieu de produit de PCR dilué, la matrice utilisée est un ADNc d’un échantillon d’intérêt afin de s’assurer que sa concentration est comprise dans la gamme.

Cette technique permet deux types de quantification : la quantification absolue (détermination en nombre de copies du gène) ou la quantification relative, méthode utilisée lors de cette étude. Elle consiste à rapporter les variations de l’expression des gènes d’intérêt détectée lors des cycles de qPCR à l’expression d’un gène de référence (stable) et d’un échantillon calibrateur. A efficacité de

PCR équivalente, le rapport d’expression entre deux conditions est calculé selon la méthode du 2-ΔΔCT

qui repose sur la formule suivante (où « éch » = « échantillon ») décrite par Livak & Schmittgen,

2001:

ΔΔCT = [(Ct gène d’intérêt éch. 1– Ct gène de référence éch. 1) – (CT gène d’intérêt éch. calibrateur– CT gène de référence éch. calibrateur)]

Le choix du gène de référence, en l’occurrence Snx17, a été basé sur la connaissance de son expression dans la gonade à un niveau relativement faible permettant la comparaison avec les niveaux d’expression de nos gènes d’intérêt ainsi que pour sa stabilité d’expression (il ne doit pas être impacté par les conditions expérimentales). L’échantillon calibrateur est quant à lui constitué d’un mélange en quantités égales des ADNc de tous les échantillons à tester.

Incubation : 2 heures à 37°C

Rinçages

Ajout TMB : incubation 20 minutes

Spectrophotomètre : lecture à 450 nm Ajout HCL 2N

Anticorps anti-LH lié à la paroi du puits

Plaque 96-puits

TMB TMB

Plasma contenant des molécules de LH

Second anticorps anti-LH couplé à une peroxydase