Paramètres étudiés

a) Suivi du pH

Le pH est suivi à l’aide d’une station pH mètre Denver Instruments. Les prélèvements sont préalablement filtrés. Le pH est alors mesuré sur le filtrat.

b) Cinétique de disparition des herbicides et des explosifs

Préalablement à l’extraction des composés organiques, 15 mL de tampon phosphate

KH2PO4 5mM à pH 7,2 sont ajoutés à 15mL de filtrat. L’extraction est réalisée grâce à des

cartouches de type SPE tel qu’il a été décrit dans le chapitre 2. c) Suivi des anions

La phase minérale est récupérée lors de l’extraction des composés organiques. En effet lors de l’extraction par SPE, la phase minérale est éluée de la cartouche alors que les composés d’intérêt sont fixés sur la colonne. Cette phase minérale a été conservée en vue du dosage des ions. Un volume de 1mL de phase minérale est placé dans un pilulier. Le dosage des anions a été effectué grâce à une chromatographie ionique « Ion chromatography system, DIONEX ICS 100 ». Ainsi la SPE aura permis de séparer efficacement les fractions minérales et organiques qui pourront être dosées.

d) Suivi des populations grâce au FISH (Fluorescent in situ hybridization) Le FISH est une méthode destinée à repérer la présence de molécules cibles par un système de fluorophores portés par de courtes séquences d’ADN (Moter et Gobel, 2000 ; Jang et al., 2005). Dans le cas qui nous intéresse, cette méthode permet d’étudier des cellules entières (les bactéries) en utilisant des sondes oligonucléotidiques dirigées sur l’ARN 16s (identité spécifique des bactéries).

Rappel :

Les ribosomes sont formés de deux sous-unités comportant chacune des protéines ribosomales assemblées sur une matrice d'acides ribonucléiques (ARNr). Les ARN ribosomiques (soit de la petite sous unité: ARNr 16S, soit de la grande sous-unité du ribosome: ARNr 23S) se sont imposés comme référence de taxonomie moléculaire.

Cette méthode a été développée dans le but de suivre l’évolution au cours du temps des espèces de bactéries susceptibles de dégrader les composés d’intérêt. Les sondes ont été

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conçues pour cibler spécifiquement certaines séquences majoritaires retrouvées lors de l’identification des microorganismes bactériens présents dans les sédiments de la lagune.

Grâce au FISH, l’identité phylogénétique, la morphologie, le nombre et l’arrangement spatial des microorganismes dans un environnement donné peuvent être évalués.

Les sondes sont marquées par un fluorochrome à leur extrémité 5’. Deux types de fluorochromes sont ainsi utilisés. Le fluorochrome Cy3 (rouge) est assigné à un groupe de bactéries (famille ou genre) tandis que le fluorochrome FITC (vert) est assigné à toutes les bactéries. Ainsi les cellules qui contiennent les sondes hybridées peuvent être observées directement en microscopie à fluorescence. L’association de ces deux couleurs donne la couleur jaune par superposition de fluorescence.

Afin d'étudier le rapport entre une population bactérienne donnée et l'ensemble des microorganismes présents dans les sédiments, deux types de sondes ont été utilisées : une sonde spécifique à chacune des bactéries et diverses autres sondes spécifiques de plusieurs grandes familles bactériennes dont nous supposons la présence dans le sédiment.

Il devient alors possible pour chaque type de sonde utilisée de calculer la densité bactérienne du sédiment. Pour cela les bactéries visibles sont dénombrées dans le champ du

microscope. Ce nombre est ensuite ramené à un nombre de microorganismes par mm2.

L'abondance relative d'une famille par rapport à l'ensemble des bactéries du sédiment peut

également être calculée. Pour cela on divise le nombre xi de bactéries comptées pour une

famille précise par le nombre total de bactéries comptées pour cet échantillon.

Dans notre étude, les sondes sont ainsi appliquées au contenu des réacteurs afin d’évaluer l’évolution des microorganismes présents. En effet, les microorganismes se développent en fonction de leur substrat, et si celui-ci vient à disparaître, les bactéries doivent trouver une autre source d’énergie ou disparaître. L’identification de souches présentes dans les fermentations liquides ont permis d’orienter le choix des sondes et de les diriger sur des genres ou des familles de microorganismes définies (Pseudomonas, Nitrosomonas, Enterobacter, Archeobacter, Nitrobacter, α Protéobactéries, β Protéobacteries, γ Protéobacteries, …). Ces sondes ont été ajoutées aux prélèvements effectués durant la cinétique de fonctionnement des réacteurs. Des lames de microscopie comportant 8 puits ont été utilisées, ces puits comportent un léger relief permettant de réaliser différents traitements sur une même lame. (Cf Figure 56)

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Figure 56 : Lame de microscopie pour hybridation in situ par fluorescence à 8 puits.

Les premiers essais ont été réalisés au temps 150 jours (après 5 mois de fonctionnement du réacteur), sur un deuxième réacteur. Ainsi le sédiment extrait du réacteur a été fixé, puis placé sur une lame et exposé à différentes sondes. Le protocole exact est détaillé en Annexe VIII.

Différentes sondes ont été appliquées aux prélèvements. Les bactéries que nous avons étudiées peuvent être regroupées en différentes classes regroupées dans le Tableau 21.

Tableau 21 : Sondes FISH appliquées aux familles et à certaines espèces de bactéries. Sondes appliquées aux familles / classes ou

domaines de microorganismes

Sondes appliquées aux espèces (correspondant aux genres bactériens)

α Proteobacteries Nitrobacter

β Proteobacteries Nitrosomonas

δ Proteobacteries Geobacter

γ Proteobacteries Pseudomonas, Enterobacter

Firmicutes (ou LGC) Clostridium

Archébacteries e) Suivi d’un réacteur par traçage radioactif

Etant donné la complexité de la boue l’identification précise de métabolites issus de la dégradation des composés nitrés a été difficile. Dans l’objectif d’identifier des métabolites,

l’ajout de [14C]-hexogène sur un réacteur a été envisagé. Deux expériences principales ont été

menées. Tout d’abord, du [14C]-hexogène a été ajouté à un réacteur ayant déjà fonctionné

pendant plus de 100 jours, afin d’évaluer la faisabilité et contrôler une éventuelle dégradation de l’hexogène. Par la suite, un réacteur a été réinitié dans l’objectif de recréer une dynamique

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TNT et du [14C]-hexogène. Ces expériences sont le fruit d’une collaboration entre le

laboratoire ECOLAB et le laboratoire des Xénobiotiques de l’INRA de Saint Martin du Touch.

1. Surcharge du réacteur par du [14C]-hexogène

Une première expérience incluant du [14C]-hexogène a été lancée sur un réacteur ayant

déjà fonctionné pendant 105 jours. Ce réacteur a été préalablement déplacé dans le laboratoire des Xénobiotiques de l’INRA, habilité à travailler sur des matériaux radioactifs. Après ajout

de 15 µCi de [14C]-hexogène et 29,4 mg d’hexogène froid, des prélèvements de 500mL ont

été effectués à intervalles réguliers de 0 à 8 semaines.

Préparation des échantillons : chaque prélèvement est préalablement filtré sur GFA (fibre de verre) de 4,7 cm de diamètre afin de se débarrasser des matières en suspension.

Un millilitre de filtrat est ajouté à 20 mL d’ultimer gold scintillant pour le comptage de la radioactivité. Le comptage est effectué par un scintillateur Beta Packard A2200.

Une étape de préconcentration sur cartouche Envi C18 (5g), Supelco. L’élution est réalisée par un volume de 8,5mL de MeOH à 100%. La radioactivité est également dosée après cette étape. Le volume d’éluat est ramené à 100µL grâce à un speed vac (appelée phase séchée).

Les conditions chromatographiques sont les suivantes :

- HPLC Packard

- colonne C18 ( Bischoff RP column )

- Solution A : Acétonitrile (ACN)/ Eau (3 : 97)

- Solution B : ACN /Eau (40 : 60)

- Débit 1mL.mn-1

- Température de colonne : 40°C.

- Gradient linéaire de 45mn (passe de 100% de solution A à 100% de solution

B en 45 minutes).

- 10µL de phase séchée sont dilués avec 100µL de solvant A pour injection.

Le dosage de la radioactivité est effectué par un flo one Beta A515 ainsi que par un scintillateur flowscint : 2mL/1mL de phase. Le temps de rétention de l’hexogène est de 13,9mn.

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2. Surcharge d’un réacteur à t=0 par du [14C]-hexogène et du [14C]- TNT

Une seconde expérience a été réalisée au laboratoire des xénobiotiques de l’INRA en relançant un réacteur à t=0 dans les mêmes conditions que celles décrites au paragraphe A et B. Deux produits radiomarqués ont été ajoutés après 2 jours de stabilisation du réacteur, à savoir du TNT et de l’hexogène dans les concentrations respectives suivantes : 17,2 µCi et 36µCi.

Le dosage des composés s’est effectué selon le même protocole que celui décrit précédemment.

I. Résultats