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I- Technique d’IHC

- Choix de l’anticorps : Revue de littérature

- 6 articles de validation d’anticorps dont 2 sur FFPE

- > 40 articles rapportant la détection de la télomérase par IHC dont au moins 6 dans le sein.

- Anticorps choisi : Anti-hTERT de Rockland

Validé par : Western Blot, Immunofluorescence et spectrométrie de masse peptidique (Wu YL, J Cell Sci. 2006) ; (Fabricius EM, Int J Oncol. 2009 ; Jakupciak JP, Biotech Histochem. 2009)

Utilisation sur tissu FFPE : 2 articles (Forsyth R, J Pathol 2008 ; Wellenhofer A, Arch Pathol Lab Med. 2012)

- Optimisation : Ac anti-hTERT Rockland – 600-401-252S - Procédures : Tableau 1

- Conclusions et conduite à tenir :

 Tester l’Ac sur des cellules hTERT+ non fixées en paraffine  Refaire Essai au pT-LINK avec et sans déparaffinage

 Changer de tissu témoin

 Tester différentes conditions de démasquage au bain-marie et

différents temps au cooker [Réf : Antigen retrieval

immunohistochemistry based research and diagnostics_Shi, Shan- Rong, 1936-2010]

 Essayer un autre anticorps

Time Antigen Retrieval Solution pH

Acidic Neutral Basic

1 minute Slide #1 Slide #2 Slide #3

5 minutes Slide #4 Slide #5 Slide #6

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Tableau 1 - Optimisation: Ac anti-hTERT Rockland – 600-401-252S Conditions Dilutions Démasquage H2O2 Blocage Incubation

Ac Iaire DAB Résultats Essai # 1 Protocole standard du labo TMA témoin 1:250 1:500 1:1000 - Citrate pH6 - Cooker micro-onde - 6 min 5min - 10min

- Lavage 1h 2x 5min - Pas de marquage des noyaux dans tissus contrôles positifs - Bruit de fond ± diffus et intense en intra- cytoplasmique et extracellulaire ; très fort dans les tissus contrôles négatifs - Lame contrôle sans Ac non colorée Essai # 2 TMA témoin 1 :500 1 :1000 1 :2500 1 :5000

Idem #1 10min - 10min - Avec et sans lavage - 1h - Overnight 2x 5min Idem #1 Essai # 3 amygdale 1:2500 1:5000 1:10000 Avec (Idem #1) et sans 10min Et 15min - 10min - 20min - avec et sans lavage - 1h - Diluant de Dako 2x 5min Et 1x 5min

- Pas de marquage nucléaire pour les 3 dilutions

-Bruit de fond plus important avec 1 :250 e t DAB 2x

- Pas de bruit de fond avec 1:500 et 1:1000 Essai # 4 amygdale 1 :5000 Avec et sans perméabi lisation au NP-40 - Idem #1 - pH9 / pT-link 15min -20min -sans lavage - 1h - 2h -Overnight -diluant de Dako 2x 5min

- Pas de marquage nucléaire ni de bruit de fond à 1h d’incubation

- Pas de marquage nucléaire et très faible bruit de fond à 2h d’incubation - Pas de marquage nucléaire avec démasquage pH6 avec ou sans perméabilisation au NP-40 - Marquage nucléaire ± diffus avec démasquage pH9 à incubation overnight, avec bruit de fond extracellulaire minime, intracellulaire cytoplasmique modéré ; marquage des cellules épithéliales de la muqueuse pavimenteuse, sur toutes les couches. Essai # 5 amygdale 1 :5000 Avec et sans perméabil isation au NP-40

pH9 / cooker 15min -20min -sans lavage -Overnight -diluant de Dako 2x 5min Et 1x 5min

- Tissu détruit : cellules fantomatiques, non colorées par l’hématoxyline ; pas de marquage IHC Essai # 6 amygdale 1:200 1:100 -Citrate pH6 -Cooker micro-onde 3min 15min -20min - 1h - 2h -Overnight -diluant de Dako 2x 5min

- Marquage/bruit de fond uniforme - ± marquage nucléaire

dot/granulaire/membrane nucléaire sur lymphocytes et cellules malpighiennes - Dilution 1:200 incubation 1h suffisants Essai # 7 amygdale 1 :200 -Citrate pH6, -60° C bain-marie - 30 min 15min -20min - 1h

-diluant Dako 2x 5min - Bruit de fond diffus - Rares noyaux lymphocytes marqués - Marquage kératinocytes couche spineuse: noyaux et/ou desmosomes Essai # 8 amygdale 1 :200 Dans bain-marie 95- 100° C : - pH6 20 min - pH7.5 60 min - pH9 10 min 15min -20min - 1h - Diluant de Dako 2x

5min - pH6 et 9 : marquage/bruit de fond uniforme-± marquage nucléaire dot/granulaire/membrane nucléaire sur lymphocytes et cellules malpighiennes - pH7 : bruit de fond moins marqué, noyaux mieux individualisés ; kératinocytes tjs marqués

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II- Technique de FISH

- Revues de littérature :

- Technique de FISH pour les télomères :

 Près de 32 articles avec description de la technique de FISH sur tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), dont 4 dans le sein.  Article de référence avec validation par Southern-blot : Meeker AK et

al, Am J Pathol 2002

 Méthodes d’évaluation : qualitative, semi-quantitative et quantitative - Choix de la méthode : Quantitative : intensité de fluorescence des signaux

télomériques.

- Choix de la sonde pour les télomères: Sonde pan-télomérique PNA- fluorochrome Cy-3 (Fournisseur : Dako recommandé par l’équipe de biologie moléculaire du service de pathologie, celles rapportées dans les articles de référence ne sont plus commercialisées)

- Logiciel de quantification : TELOMETER (ImageJ plugin) - Optimisation :

- Construction de TMA témoin avec des lignées cellulaires avec longueur des télomères mesurée :

 Lignées cellulaires avec des télomères de longueur différente : HT29 > MCF7 > BT474

 Lignée cellulaire mammaire avec différents phénotypes : MCF10 MCF10A : cellules épithéliales normales immortalisées

MCF10AT : cellules épithéliales de l’hyperplasie canalaire atypique MCF10DCIS.com : cellules de carcinome canalaire in situ

MCF10CA1a : cellules de carcinome invasif

 Paires de lobules normaux sur échantillons prélevés avec 10 ans d’intervalle (3 paires/patientes avec récidive à 10 ans)

- Résultat du marquage (Figure 1 et 2):

 Bruit de fond : ajouter les étapes optionnelles de réduction de bruit de fond et traitement par RNase

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 Signaux télomériques Cy3 très faibles : difficiles à voir au

grossissement x40 ; mieux visibles avec le filtre orange (utilisé pour l’HER2) qu’avec le filtre Cy3

 Bons signaux centromériques (les noyaux sont accessibles)  Questions :

Télomères trop courts ? : quantifier objectivement les signaux pour les lignées avec longueur différente ;

Problèmes de sonde ? : essayer une autre sonde (Panagene) ?

Figure 1: Image de FISH d’une lignée cellulaire avec télomères courts (HT29_TeloFISH témoinC3_image273)

Légende: Noyaux en bleu (DAPI), signaux centromériques en vert (FITC), signaux télomériques en rouge (Cy3)

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Figure 2 : Image de FISH d’une lignée cellulaire avec télomères longs (BT474_TeloFISH témoinC3_image581)

Légende: Noyaux en bleu (DAPI), signaux centromériques en vert (FITC), signaux télomériques en rouge (Cy3)

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- Numérisation des images pour quantification objective par le logiciel TELOMETER

- Logiciel d’acquisition d’images (metafer) : paramètres fixés optimisés pour la quantification de l’HER2

 Créer un nouveau «classificateur» pour prendre des images brutes

 Optimiser le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et le fixer pour tous les échantillons

 Problématique : Logiciel compliqué, difficile à paramétrer (aide d’un programmateur familiarisé avec le logiciel nécessaire)

 Numériser les lames de TMA avec des images complètes de chaque carotte à Gx40

Multiplicateur 3x3 utilisé pour couvrir des carottes de 0.6 mm Carottes de 1mm diamètre : multiplicateur 7x7 suggéré par le programmateur de metasystem

Multiplicateur Nombre d’image par carotte Durée d’acquisition Images du vide

7x7 48-50 >12h ≈ 25

5x5 25 >12h ≈ 1 à 9

4x4 16 ≈ 6-7h ≈ 0 à 6

- Conclusions et conduite à tenir :

 Durée d’acquisition trop longue : risque de surexposition des lames (dernières carottes > premières)

 Pas d’image globale de chaque carotte, même pour le 4x4 (code erreur : espace insuffisant pour générer l’image ‘overview’)

 Normalement pas de chevauchement des champs selon les paramètres du classificateur multiple :

Réaliser les analyses sur les images séparées ?

Essai de numérisation avec le NanoZoomer : Signaux rouges non visibles; images non optimales pour les sondes de FISH.

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* Prendre les images avec le logiciel AxioVision (module TMA nécessaire (LOEX) ou vérifier la possibilité de faire activer AxioVision du service de pathologie)?

* Créer un classificateur dans metafer/metacyte pour le décompte automatique/semi-automatique des spots télomériques et lui faire générer les mesures d’intensité moyenne par noyau avec la valeur du DAPI pour chaque noyau ?

III- Technique de qPRC

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