I- Technique d’IHC
- Choix de l’anticorps : Revue de littérature
- 6 articles de validation d’anticorps dont 2 sur FFPE
- > 40 articles rapportant la détection de la télomérase par IHC dont au moins 6 dans le sein.
- Anticorps choisi : Anti-hTERT de Rockland
Validé par : Western Blot, Immunofluorescence et spectrométrie de masse peptidique (Wu YL, J Cell Sci. 2006) ; (Fabricius EM, Int J Oncol. 2009 ; Jakupciak JP, Biotech Histochem. 2009)
Utilisation sur tissu FFPE : 2 articles (Forsyth R, J Pathol 2008 ; Wellenhofer A, Arch Pathol Lab Med. 2012)
- Optimisation : Ac anti-hTERT Rockland – 600-401-252S - Procédures : Tableau 1
- Conclusions et conduite à tenir :
Tester l’Ac sur des cellules hTERT+ non fixées en paraffine Refaire Essai au pT-LINK avec et sans déparaffinage
Changer de tissu témoin
Tester différentes conditions de démasquage au bain-marie et
différents temps au cooker [Réf : Antigen retrieval
immunohistochemistry based research and diagnostics_Shi, Shan- Rong, 1936-2010]
Essayer un autre anticorps
Time Antigen Retrieval Solution pH
Acidic Neutral Basic
1 minute Slide #1 Slide #2 Slide #3
5 minutes Slide #4 Slide #5 Slide #6
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Tableau 1 - Optimisation: Ac anti-hTERT Rockland – 600-401-252S Conditions Dilutions Démasquage H2O2 Blocage Incubation
Ac Iaire DAB Résultats Essai # 1 Protocole standard du labo TMA témoin 1:250 1:500 1:1000 - Citrate pH6 - Cooker micro-onde - 6 min 5min - 10min
- Lavage 1h 2x 5min - Pas de marquage des noyaux dans tissus contrôles positifs - Bruit de fond ± diffus et intense en intra- cytoplasmique et extracellulaire ; très fort dans les tissus contrôles négatifs - Lame contrôle sans Ac non colorée Essai # 2 TMA témoin 1 :500 1 :1000 1 :2500 1 :5000
Idem #1 10min - 10min - Avec et sans lavage - 1h - Overnight 2x 5min Idem #1 Essai # 3 amygdale 1:2500 1:5000 1:10000 Avec (Idem #1) et sans 10min Et 15min - 10min - 20min - avec et sans lavage - 1h - Diluant de Dako 2x 5min Et 1x 5min
- Pas de marquage nucléaire pour les 3 dilutions
-Bruit de fond plus important avec 1 :250 e t DAB 2x
- Pas de bruit de fond avec 1:500 et 1:1000 Essai # 4 amygdale 1 :5000 Avec et sans perméabi lisation au NP-40 - Idem #1 - pH9 / pT-link 15min -20min -sans lavage - 1h - 2h -Overnight -diluant de Dako 2x 5min
- Pas de marquage nucléaire ni de bruit de fond à 1h d’incubation
- Pas de marquage nucléaire et très faible bruit de fond à 2h d’incubation - Pas de marquage nucléaire avec démasquage pH6 avec ou sans perméabilisation au NP-40 - Marquage nucléaire ± diffus avec démasquage pH9 à incubation overnight, avec bruit de fond extracellulaire minime, intracellulaire cytoplasmique modéré ; marquage des cellules épithéliales de la muqueuse pavimenteuse, sur toutes les couches. Essai # 5 amygdale 1 :5000 Avec et sans perméabil isation au NP-40
pH9 / cooker 15min -20min -sans lavage -Overnight -diluant de Dako 2x 5min Et 1x 5min
- Tissu détruit : cellules fantomatiques, non colorées par l’hématoxyline ; pas de marquage IHC Essai # 6 amygdale 1:200 1:100 -Citrate pH6 -Cooker micro-onde 3min 15min -20min - 1h - 2h -Overnight -diluant de Dako 2x 5min
- Marquage/bruit de fond uniforme - ± marquage nucléaire
dot/granulaire/membrane nucléaire sur lymphocytes et cellules malpighiennes - Dilution 1:200 incubation 1h suffisants Essai # 7 amygdale 1 :200 -Citrate pH6, -60° C bain-marie - 30 min 15min -20min - 1h
-diluant Dako 2x 5min - Bruit de fond diffus - Rares noyaux lymphocytes marqués - Marquage kératinocytes couche spineuse: noyaux et/ou desmosomes Essai # 8 amygdale 1 :200 Dans bain-marie 95- 100° C : - pH6 20 min - pH7.5 60 min - pH9 10 min 15min -20min - 1h - Diluant de Dako 2x
5min - pH6 et 9 : marquage/bruit de fond uniforme-± marquage nucléaire dot/granulaire/membrane nucléaire sur lymphocytes et cellules malpighiennes - pH7 : bruit de fond moins marqué, noyaux mieux individualisés ; kératinocytes tjs marqués
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II- Technique de FISH
- Revues de littérature :
- Technique de FISH pour les télomères :
Près de 32 articles avec description de la technique de FISH sur tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), dont 4 dans le sein. Article de référence avec validation par Southern-blot : Meeker AK et
al, Am J Pathol 2002
Méthodes d’évaluation : qualitative, semi-quantitative et quantitative - Choix de la méthode : Quantitative : intensité de fluorescence des signaux
télomériques.
- Choix de la sonde pour les télomères: Sonde pan-télomérique PNA- fluorochrome Cy-3 (Fournisseur : Dako recommandé par l’équipe de biologie moléculaire du service de pathologie, celles rapportées dans les articles de référence ne sont plus commercialisées)
- Logiciel de quantification : TELOMETER (ImageJ plugin) - Optimisation :
- Construction de TMA témoin avec des lignées cellulaires avec longueur des télomères mesurée :
Lignées cellulaires avec des télomères de longueur différente : HT29 > MCF7 > BT474
Lignée cellulaire mammaire avec différents phénotypes : MCF10 MCF10A : cellules épithéliales normales immortalisées
MCF10AT : cellules épithéliales de l’hyperplasie canalaire atypique MCF10DCIS.com : cellules de carcinome canalaire in situ
MCF10CA1a : cellules de carcinome invasif
Paires de lobules normaux sur échantillons prélevés avec 10 ans d’intervalle (3 paires/patientes avec récidive à 10 ans)
- Résultat du marquage (Figure 1 et 2):
Bruit de fond : ajouter les étapes optionnelles de réduction de bruit de fond et traitement par RNase
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Signaux télomériques Cy3 très faibles : difficiles à voir au
grossissement x40 ; mieux visibles avec le filtre orange (utilisé pour l’HER2) qu’avec le filtre Cy3
Bons signaux centromériques (les noyaux sont accessibles) Questions :
Télomères trop courts ? : quantifier objectivement les signaux pour les lignées avec longueur différente ;
Problèmes de sonde ? : essayer une autre sonde (Panagene) ?
Figure 1: Image de FISH d’une lignée cellulaire avec télomères courts (HT29_TeloFISH témoinC3_image273)
Légende: Noyaux en bleu (DAPI), signaux centromériques en vert (FITC), signaux télomériques en rouge (Cy3)
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Figure 2 : Image de FISH d’une lignée cellulaire avec télomères longs (BT474_TeloFISH témoinC3_image581)
Légende: Noyaux en bleu (DAPI), signaux centromériques en vert (FITC), signaux télomériques en rouge (Cy3)
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- Numérisation des images pour quantification objective par le logiciel TELOMETER
- Logiciel d’acquisition d’images (metafer) : paramètres fixés optimisés pour la quantification de l’HER2
Créer un nouveau «classificateur» pour prendre des images brutes
Optimiser le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et le fixer pour tous les échantillons
Problématique : Logiciel compliqué, difficile à paramétrer (aide d’un programmateur familiarisé avec le logiciel nécessaire)
Numériser les lames de TMA avec des images complètes de chaque carotte à Gx40
Multiplicateur 3x3 utilisé pour couvrir des carottes de 0.6 mm Carottes de 1mm diamètre : multiplicateur 7x7 suggéré par le programmateur de metasystem
Multiplicateur Nombre d’image par carotte Durée d’acquisition Images du vide
7x7 48-50 >12h ≈ 25
5x5 25 >12h ≈ 1 à 9
4x4 16 ≈ 6-7h ≈ 0 à 6
- Conclusions et conduite à tenir :
Durée d’acquisition trop longue : risque de surexposition des lames (dernières carottes > premières)
Pas d’image globale de chaque carotte, même pour le 4x4 (code erreur : espace insuffisant pour générer l’image ‘overview’)
Normalement pas de chevauchement des champs selon les paramètres du classificateur multiple :
Réaliser les analyses sur les images séparées ?
Essai de numérisation avec le NanoZoomer : Signaux rouges non visibles; images non optimales pour les sondes de FISH.
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* Prendre les images avec le logiciel AxioVision (module TMA nécessaire (LOEX) ou vérifier la possibilité de faire activer AxioVision du service de pathologie)?
* Créer un classificateur dans metafer/metacyte pour le décompte automatique/semi-automatique des spots télomériques et lui faire générer les mesures d’intensité moyenne par noyau avec la valeur du DAPI pour chaque noyau ?
III- Technique de qPRC