Le mode de fonctionnement des miARN chez les plantes

Du gène au miARN mature

La synthèse de miARN nécessite plusieurs étapes de maturation. À l’inverse des animaux, où une partie importante des miARN est produite à partir de séquences introniques, chez les plantes la majorité des miARN est produite à partir de gènes qui leur sont spécifiquement dédiés (mais peuvent être tout de même aussi produits par des séquences introniques [128]). De façon générale, un gène ne résulte en la production que d’un seul miARN bien que dans de rares cas un même gène puisse être à l’origine de plusieurs précurseurs de miARN via la formation de plusieurs tige-boucle dans un même transcrit [156].

Tout comme pour les gènes qui sont traduits en protéines, c’est l’ARN po- lymérase II (Pol II) qui est chargée de la transcription des gènes de miARN (Figure 1.4). Ces gènes utilisent ainsi la même machinerie que le reste des gènes et peuvent donc être soumis aux mêmes mécanismes de régulation transcrip- tionnelle et s’intègrent au sein des réseaux de régulation de la cellule [111]. De la même façon que les ARNm sont modifiés, l’ARN produit par les gènes de miARN va subir un ensemble de modifications comme l’ajout d’une coiffe en 5’, d’une queue poly-A en 3’ [180] et parfois même un épissage [69].

Le transcrit ainsi obtenu est appelé transcrit primaire, ou pri-miARN. La

taille de ce pri-miARN peut varier entre 50 et 900 nucléotides [17, 27]. Le pri- miARN forme des structures secondaires de taille et de forme variables. Il est cependant caractérisé par l’existence d’une tige imparfaite issue du repliement par complémentarité de séquence du pri-miARN [113]. Le pri-miARN va subir plusieurs modifications (Figure 1.4). Tout d’abord, un complexe enzymatique comprenant DCL1 va procéder à un premier clivage précis, généralement au niveau de la tige. À cette étape, l’intermédiaire est appeléprécurseur, noté pré-

miARN. Le pré-miARN hérite de la structure en tige-boucle du pri-miARN. Le pré-miARN va être clivé de nouveau par DCL1 pour n’obtenir plus qu’une structure double brin d’environ 20 à 24 nucléotides, un duplex composé du

miARN et de sa séquence quasi-complémentaire, le miARN∗, ou guide. Les imperfections de la tige au niveau du duplex (renflements etmismatchs) semblent

Noyau

Gène de miARN Pri-miARN duplex miARN-miARN* DCL1 Pré-miARN DCL1

Cytoplasme

HASTY miARN miARN* dégradation du miARN* ARNm

Clivage et dégradation de l'ARNm cible inhibition de la traduction de l'ARNm cible

RISC

ARNm

Ribosome RISC

ARNm

Figure1.4 – Biogenèse des miARN et mode desilencing d’un ARNm cible dans le modèle végétal.

une méthylation par HEN1. Ce duplex est ensuite exporté du noyau vers le cytoplasme de la cellule par le transporteur HASTY.

Le duplex est alors dissocié par une hélicase en deux molécules d’ARN simple brin : le miARN mature d’un coté et miARN∗ de l’autre. La localisation de cette étape n’est pas très bien connue, et pourrait aussi bien être nucléaire que cytoplasmique. A ce stade, le miARN mature est associé à la protéine Argonaute (AGO) et forme le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui sera

le véritable effecteur du silencing. Le complexe RISC peut également inclure d’autres partenaires protéiques. Alors que chez l’humain, il existe huit protéines Argonaute, chezA. thaliana il en existe dix paralogues dont les fonctions sont

associées à différents mécanismes de silencing. Les miARN sont majoritairement associés à AGO1.

Mécanismes de silencing

Les miARN, chargés dans un complexe RISC possèdent chez les plantes une forte complémentarité avec une partie de la séquence de leurs ARNm cibles. C’est grâce à cette complémentarité que le miARN guide spécifiquement le complexe RISC sur l’ARNm ciblé. Ce ciblage est la base de différents mécanismes d’inhibition de l’expression. Dans certains cas, la fixation du complexe RISC sur l’ARNm va empêcher la transcription en bloquant l’activité du ribosome. Chez les animaux, ce mécanisme est courant et a été décrit en détails, incluant le blocage de l’assemblage du ribosome sur l’ARNm, le détachement du ribosome alors qu’il est en cours de traduction, la dégradation de la protéine au fur et à mesure de la traduction et le recrutement d’autres protéines provoquant la déstabilisation de l’ARNm qui est alors dégradé [153]. Dans d’autre cas, lesilencing s’effectue

au travers du clivage de l’ARNm réalisé par la protéine AGO1 contenue dans le complexe RISC. Ce clivage est permis par l’activité RNAse du domaine PIWI de la protéine AGO1. Chez les animaux, le blocage de la traduction semble le plus fréquent, tandis que chez les plantes le clivage semble prédominant [10]. Dans la majorité des cas décrits à ce jour pour les plantes, le ciblage semble s’effectuer sur une portion de l’ARNm (régions exoniques ou UTR). Je réfèrerai à ce mode de ciblage comme le mode "canonique". Cependant, des études récentes

ont montré que d’autres modes de ciblage, encore mal connus, sont possibles. En particulier, [112] a montré que certaines cibles de miARN étaient localisées dans les introns de certains gènes chez le riz. Dans ce cas, il est envisageable que l’ARN pré-messager soit en fait la cible réelle malgré sa demi-vie limitée au sein de la cellule. Plus récemment encore, [159] a démontré expérimentalement l’existence de cibles de miARNs en amont du site d’initiation de la transcription du gène SCR (S locus cystein rich protein) au locus d’auto-incompatibilité chez Brassica. Dans ce cas, l’ARNm ne peut pas être la cible, et un mécanisme de méthylation de l’ADN lui-même semble être responsable du silencing du gène cible. Ces deux exemples illustrent que les modes de ciblage peuvent-être plus divers qu’initialement envisagés dans la littérature. Je réfèrerai collectivement à ces mécanismes comme les modes "non-canoniques".

1.3

Recherche de cibles de miARN

Nous venons de voir le mode d’action des miARN en tant que régulateurs post-transcriptionnel en ciblant l’ARNm. Un aspect central de la compréhension de la structure des réseaux de régulations qui en émerge consiste à connaître les cibles de chaque miARN du génome. Des méthodes expérimentales de recherche de ciblesex nihilo existent, mais cette tâche reste l’un des verrous principaux du

domaine en raison de la difficulté de la prédiction et de la validation des cibles de miARN. Les approches expérimentales mises en œuvre peuvent se révéler particulièrement difficiles, longues et coûteuses. De ce fait, de nombreux travaux ont cherché à prédirein silico ces cibles pour guider et faciliter leur identification

expérimentale.

Après avoir présenté quelques méthodes expérimentales pour l’identification de cibles, je présenterai les principales caractéristiques des cibles connues par rapport au miARN associé afin d’établir un modèle et présenter les principaux outils de prédictionin silico disponibles dans la littérature.

Dans le document Pépite | Algorithmique pour la recherche de motifs approchée et application à la recherche de cibles de microARN (Page 32-36)