Mesures de densités de courant biocatalytiques de l’ORR pour différentes méthodes d’immobilisation de la Laccase

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III.2. Résultats et discussion

III.2.2. Mesures de densités de courant biocatalytiques de l’ORR pour différentes méthodes d’immobilisation de la Laccase

Une fois la surface de nos biocathodes graphite/a-CN0,17 et graphite/a-CN0,17 AT caractérisée, leurs performances envers l’électrocatalyse de la réduction de l’oxygène ont été évaluées par voltampérométrie cyclique après greffage de la laccase. La mesure des courants de réduction de l’oxygène a été réalisée dans un tampon acétate possédant un pH égal à 4,2 en utilisant comme sel de fond 0,1 M de NaClO4 et à un potentiel égal à 0,2 V/ECS (Figure III.7) auquel aucun courant faradique ne peut être détecté en l’absence d’oxygène dans la solution.

80 Figure III.7: Voltampérogrammes d’une électrode graphite/a-CN0,17/laccase obtenus dans une solution saturée en oxygène (courbe rouge), et en l’absence d’oxygène sous N2 (courbe

noire)

Figure III.8: Densités de courants pour les différentes stratégies d’immobilisation de la laccase

Différentes méthodes d’immobilisation de la laccase ont été évaluées sur les deux types d’électrodes (graphite/a-CN0,17 et graphite/a-CN0,17 AT) au cours de ce travail (Figure III.8, Tableau III.2). Signalons que les mesures de densités de courant ont été répétées pour chaque méthode d’immobilisation sur trois électrodes différentes dans le cadre d’un contrôle de la reproductibilité. On constate que pour les deux types d’électrodes, l’immobilisation de la laccase par adsorption fournit les densités de courants les plus faibles. On mesure des densités de courants de -3,5  1,2 µA/cm2 et de -13,1 ± 2,8 µA/cm2 pour des électrodes graphite/a-CN0,17

et graphite/a-CN0,17 AT respectivement. L’immobilisation par greffage covalent (formation d’une liaison amide) avec activation a permis d’augmenter considérablement les densités de courants. En effet, dans le cas d’une électrode graphite/a-CN0,17, on a multiplié par deux les densités de courant (-7  1,4 µA/cm2 au lieu de -3,5  1,2 µA/cm2). Dans le cas d’une électrode

adsorption liaison amide liaison imine liaison imine+amide 0

81 graphite/a-CN0,17 AT, les courants ont été multipliés par trois (-39,6  6,6 µA/cm2 au lieu de -13,1 ± 2,8 µA/cm2). On remarque aussi que l’immobilisation covalente de la laccase par la formation d’une liaison amide sur une électrode graphite/a-CN0,17 AT permet d’avoir de meilleurs résultats que sur une électrode graphite/a-CN0,17. On retrouve les mêmes résultats que ceux de la littérature [3]. A ce stade, deux hypothèses pourraient expliquer ce résultat : soit la quantité d’enzyme immobilisée est plus élevée (grâce à la plus forte densité des groupements carboxyliques), soit l’orientation de l’enzyme est plus favorable au transfert des électrons dans le cas d’une surface fonctionnalisée avec des groupements COOH. Pour rappel, afin d’optimiser le transfert d’électrons entre la surface de l’électrode et la laccase, une hypothèse largement reprise dans la littérature est qu’il est préférable que le cuivre T1 soit le plus proche possible de la surface de l’électrode. Dans le cas des électrodes possédant des groupements carboxyliques à la surface, la laccase va s’immobiliser majoritairement via ses groupements amines dont deux sont sur la même face que le site T1 et trois sur la face opposée. Par opposition, dans le cas d’une surface avec des groupements amines (cas de graphite/a-CN0,17), la laccase va s’immobiliser via l’un (ou plusieurs) de ses groupements carboxyliques répartis aléatoirement sur l’enzyme. On aura alors une orientation aléatoire moins bénéfique pour la communication électronique entre l’enzyme et l’électrode.

Une méthode alternative à la formation d’une liaison amide entre l’électrode et l’enzyme consiste à immobiliser la laccase par la formation d’une liaison imine entre les groupements amines de l’électrode et les sites de glycosylation de la laccase. Pour cela, l’enzyme a été préalablement oxydée afin de créer des sites aldéhyde sur ses sites de glycosilation. Deux des quatre sites de glycosylation de la laccase (cf Figure I.15) étant du même côté que le cuivre T1, ce type de greffage peut permettre d’avoir une orientation favorable de l’enzyme. Dans ce type de greffage, aucun agent de couplage n’est nécessaire. Toutefois on a réalisé l’immobilisation de la laccase oxydée à la fois en absence et en présence du mélange EDC-NHS, agent de couplage nécessaire à la formation de la liaison amide afin de pouvoir comparer l’immobilisation de la laccase oxydée ou non toutes choses égales par ailleurs. On observe qu’en présence, comme en absence d’EDC-NHS, les densités de courant mesurées pour des électrodes graphite/a-CN0,17 ou graphite/a-CN0,17 AT sont quasiment identiques. Une explication pourrait être que la vitesse de réaction de la formation de la base de Schiff est plus rapide que celle de la formation de la liaison amide. La densité de courant la plus importante a

82 été obtenue dans le cas d’une électrode graphite/a-CN0,17 AT sur laquelle la forme oxydée de la laccase a été immobilisée en présence de l’agent de couplage : On a mesuré une densité de courant égale à -44,6  9,9 µA/cm2. Mais si on tient compte de l’erreur expérimentale, le courant obtenu n’est pas significativement plus élevé que celui obtenu avec la laccase oxydée sans le mélange EDC-NHS). Ce résultat pourrait s’expliquer par le fait que dans ce cas, l’enzyme est immobilisée à la surface de l’électrode soit via ses groupements amines, soit via ses sites de glycosilation suivant une orientation favorable dans les deux cas au transfert d’électrons (formation de liaisons imine ou amide grâce respectivement aux fonctions aldéhydes et amines de la laccase).

Tableau III.2: Activité enzymatique et taux de couverture de la laccase sur les électrodes graphite/a-CN0,17 and graphite/a-CN0,17 AT

graphite/a-CN0,17 graphite/ a-CN0,17 AT

Adsorption Liaison Taux de couverture en enzymes électrocatalytiquement actives calculés à partir des densités de courant mesurées pour l’ORR -J (µA.cm2)

Taux de couverture en enzymes actives vis-à-vis de l’ABTS calculés à partir de l’activité

Activité, mU 21,8 ±0,4 38 ±2 32 ±2 34,4 ±0,2 8,2 ±0,4 25 ±2 8 ±4 24 ±1 Taux de

couverture /

%

64 112 105 101 24 74 24 69

Taux de couverture en enzymes calculés à partir des résultats XPS Modèle A hémisphérique

Il peut être démontré par le calcul suivant que la densité de courant attendue pour l’ORR sur une monocouche continue d’enzymes est de -631,0 µA/cm2. En effet, l’immobilisation

83 d’une monocouche de laccase sur une électrode plane conduit à des densités de courant dont la limite supérieure théorique s’exprime selon l’équation suivante (Equation III.1) :

Jmax = kcat × n × F × Γmax (Eq. III.1)

kcat représente la constante catalytique de la réaction enzymatique (350 s-1 pour l’O2 en tant que substrat [20]), n le nombre d’électrons mis en jeu lors de la réaction de réduction de l’oxygène (4 électrons), F la constante de Faraday (9,65×104 C/mol) et Γmax la concentration superficielle maximale de laccase pouvant être immobilisée à la surface de l’électrode. Elle est exprimée selon l’Equation III.2.

Γmax = nmax enzyme

Sélectrode (Eq. III.2)

nmax enzyme, le nombre maximal d’enzymes dans une monocouche de laccase à la surface l’électrode (1,8×10-12 moles) et Sélectrode la surface géométrique de l’électrode (0,38 cm2).

L’expression de nmax enzyme est décrite selon l’Equation III.3.

nmax enzyme = Sélectrode

NA × Slaccase (Eq. III.3)

NA, la constante d’Avogadro, Slaccase la surface occupée par une enzyme (3,5. 10-13 cm2).

La densité de courant maximale a donc pour expression (Equation III.4) : Jmax = kcat × n × F × N 1

A × Slaccase = 631,0 µA/cm2 (Eq. III.4)

Par comparaison avec cette valeur, il apparaît que nos densités de courant sont toutes nettement plus faibles que Jmax . Ceci pourrait être expliqué soit par le fait qu’une partie des enzymes n’est pas active, soit que la surface de l’électrode n’est pas totalement recouverte. Les taux de couverture en enzymes présentant une activité bio-électrocatalytique vis-à-vis de la réduction de l’oxygène sont rapportées dans le Tableau III.2.

III.2.3.Activité de la laccase immobilisée vis-à-vis de l’ABTS et détermination du

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