Matériels et méthodes

2.1.1.2.1.Mise en place des essais respirométriques Substrats étudiés

Les cinétiques de dégradation de quatre substrats organiques ont été étudiées à travers le suivi de la biodégradation par la méthode respirométrique.

• Un fumier de bovins issu d’une exploitation agricole d’élevage-engraissement de bovins viande (MAN)

• La phase solide du digestat (ADMAN) issu de la méthanisation à la ferme de ce fumier de bovin MAN (92 %) ainsi qu’occasionnellement des déchets verts et issues

47 de céréales (8%). La fraction solide du digestat est récoltée suite à une séparation de phases par presse à vis.

• Un biodéchet en mélange avec des déchets verts provenant d’un centre de valorisation des ordures ménagères (BIO)

• La phase solide du digestat issu de la méthanisation de ce biodéchet en co-méthanisation avec des déchets verts (ADBIO). La phase solide du digestat est récoltée suite à une séparation de phases par presse à vis, tamisage puis centrifugation.

Les substrats ont été prélevés en 2012 puis immédiatement conditionnés dans des volumes de 10L et congelés à -18°C pour bloquer toute activité de décomposition. Ils ont été décongelés à 3°C pendant une journée avant analyse ou suivi respirométrique.

Principe de la respirométrie

La méthode respirométrique utilisée a été développée par Tremier et al. (2005) et reprise par Berthe et al. (2007) (Figure 6). Le principe est de suivre les cinétiques de respiration des substrats au cours de la biodégradation à travers les mesures des concentrations en O₂ et CO₂ en entrée et en sortie de cellule dans des conditions non limitantes d’aération, de température et d’humidité. La respiration reflète l’activité microbienne par respiration hétérotrophe lors de la dégradation de la matière organique et est donc intrinsèquement liée à la qualité du substrat organique.

Environ 1.2 kg de chaque substrat est placé dans une cellule respirométrique maintenue à 40°C dans un bain marie, température optimale pour la biodégradation (Tremier et al., 2005).

Pour permettre une bonne circulation dans la matière, le substrat est mélangé à des anneaux en plastique, utilisés comme structurants inertes, et la cellule est placée sous aération recirculée entre 70 et 80 L/h. Les teneurs en O2 et CO2 des gaz en entrée et en sortie de cellules sont mesurées en continu à travers des analyseurs de gaz à détecteurs infrarouge pour le CO₂ et paramagnétique pour l’O₂ (Multor 610 et Finor) couplés à une centrale d’acquisition (Tremier et al., 2014). Les cinétiques de consommation de l’O₂ et de production du CO₂ sont ensuite calculées grâce au débit molaire de chacun des gaz, déterminé en entrée et sortie de cellule à partir des teneurs en gaz et débits mesurés. Ces cinétiques sont ensuite exprimées en mmol d’O₂ ou de CO₂.h^-1.kg^-1 de MO initiale pour permettre la comparaison entre les différents substrats.

Une première série de mesures respirométriques a été réalisée en duplicats sur chaque substrat et jusqu’à une dégradation complète de la MO attestée par un retour à une respiration basale,

48 et suite à un mélange de la matière dans les cellules pour s’assurer de la fin du processus de biodégradation. Cette première série avait pour objectif d’évaluer la répétabilité de l’expérience et d’estimer le temps et le potentiel de biodégradation des quatre substrats étudiés. La répétabilité de l’expérience a été estimée par le calcul de la différence moyenne absolue entre les cinétiques de respiration de chaque substrat (Équation 1), par la comparaison des temps et amplitudes des points remarquables (pics de respiration), ainsi que les quantités cumulées d’O2 consommée et de CO2 produit.

Équation 1 :

= ∑ | −_! |

Avec : D ́: Différence moyenne absolue de respiration entre les duplicats (mmol.h^-1.kg^-1 de MO initiale) ; n: nombre de mesure de teneur en O2 ou CO2 ; x1i: Valeur mesurée de respiration pour le duplicat 1; x_2i: Valeur mesurée de respiration pour le duplicat 2.

Une deuxième série d’expérience a été réalisée afin de caractériser la composition de la matière organique à différents stades de biodégradation. Ces analyses étant destructives, quatre (ADMAN, BIO) à cinq (MAN, ADBIO) cellules respirométriques (nommées dans la suite T1 à Tf) ont été suivies en parallèle pour chaque substrat et stoppées après différentes durées de biodégradation pour caractérisation de la matière. Les temps d’arrêt de chacune des cellules ont été déterminés à partir de l’allure des cinétiques de respiration obtenues lors de la première série d’expérimentation qui a permis l’identification de points remarquables de la biodégradation attestés par des signaux respirométriques particuliers (phases de croissance, pics, décroissance et plateau dans l’activité respirométrique). Les temps retenus pour la caractérisation de la MO sont donc les suivants : 0.4, 1.5, 6.6, 8.9 et 34.6 jours de biodégradation pour MAN; 8.8, 13, 25, 33.8 jours pour ADMAN; 2, 3.8, 6.3 et 22.4 jours pour BIO, et ; 0.4, 3.7, 7.5, 12.6 et 30 jours pour ADBIO.

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Figure 6 : Schéma de l’installation respirométrique (Berthe et al., 2007)

50 2.1.1.2.2.Méthodes analytiques

Les échantillons (matière brute globale) ont été broyés à 2 mm après immersion dans l’azote liquide (-196°C) pour permettre la solidification nécessaire pour le broyage. La fraction soluble à l’eau chaude (SOLH2O) a ensuite été extraite à l’eau bouillante pendant 1h avec un ratio échantillon/eau de 2/17 (m/m) suivi d’une centrifugation à 17700 rpm pendant 20 min.

Cette étape est similaire à la première extraction du protocole « Van Soest » décrit dans la norme Amendements organiques et supports de culture (AFNOR, 2009), mais a été réalisée en dehors de l’analyseur séquentiel pour permettre l’analyse de cette fraction soluble (azote soluble et macromolécules). La fraction non soluble à l’eau chaude (NSOL) a été ensuite séchée à 38°C pour les analyses de la MO solide (extraction des fractions suivantes). Les analyses de MO, Ct et Nt ont été réalisées sur l’échantillon global broyé et sur le NSOL pour permettre le calcul des quantités de MO, Ct et Nt dans SOLH2O.

Le protocole d’analyse d’ensemble est présenté dans la Figure 7.

Matière sèche (MS)

La matière sèche est déterminée par séchage à 80°C jusqu’à stabilisation de la masse.

Matière Organique (MO)

Après séchage pour de l’échantillon, la MO est déterminée par calcination à 250°C pendant 2h puis 3h à 550°C.

Carbone total (Ct) et azote total (Nt)

La détermination du carbone et de l’azote élémentaire est réalisée par analyseur à combustion flash (Thermo Flash 2000). 10 à 20 mg d’échantillon broyé (0.5mm) sont oxydés par combustion flash à 1800°C, en présence de catalyseur, en dioxyde de carbone ou oxydes d’azote. Le flux gazeux est ensuite séparé par chromatographie, puis un détecteur catharomètre permet le calcul des teneurs en Ct et Nt par étalonnage.

Fractionnement biochimique de type Van Soest

La fraction non soluble à l’eau chaude (NSOL) a été analysée par fractionnement biochimique selon la norme (AFNOR, 2009), sans toutefois procéder à l’extraction à l’eau, celle-ci ayant précédemment été réalisée en dehors de l’analyseur séquentiel. Elle permet la caractérisation de la fraction soluble dans un détergent neutre (1.86% EDTA-Na₂, 3% de la solution aqueuse de sodium dodecyl sulfate, 0.68% de tétraborate de sodium décahydraté , 0.45% de sel di-sodique d’hydrogénophosphate et 1.0% de tri-éthylène glycol) (SOLnd), de la fraction dite

51 hémicellulosique (HEM) (soluble dans un acide faible, acide sulfurique à 2.6% et hexadécyltriméthylammonium bromure à 2.0%), de la fraction dite cellulosique (CEL) (soluble dans un acide fort, acide sulfurique à 72 %) et de la fraction dite lignine (LIC) (non soluble dans les solutions précédentes). Chacun des résidus des extractions est calciné pour mesure de la MO, et permet d’estimer, par différence, la proportion de la MO totale extraite à chaque étape. Les fractions ont aussi été exprimées en pourcentage du Ct et de Nt, en substituant une analyse Ct et Nt à la place de la calcination des résidus des extractions.

Macromolécules solubles

Les macromolécules solubles à l’eau chaude (dans la fraction SOLH2O) ont été caractérisées en fonction de leurs poids moléculaires par chromatographie liquide haute performance (HPLC) d'exclusion stérique combinée à un détecteur de lumière dispersée par évaporation (ELSD, Varian 385LC). L'intensité des chromatogrammes a été mesurée en mvolt (par évaporation et nébulisation à 40 °C). Les temps d’élution ont été associés à des poids moléculaires par calibration avec des molécules Dextran, ce qui a permis le découpage du chromatogramme en classe de taille de macromolécules et ainsi la détermination de la part de chaque classe (de moins de 1 kDa à plus de 70 kDa) dans les macromolecules totales (en % de la surface totale du chromatogramme). Bien que la méthode HPLC ne soit pas purement quantitative, la division de la surface des chromatogrammes par classe de taille de molécules permet une estimation de la distribution des poids des molécules solubles à l’eau chaude (Tremier et al., 2014).

Le seuil considéré en-deçà duquel les molécules sont très rapidement accessibles pour la biomasse microbienne est de 1.5 kDa. En effet, il a été montré sur des eaux usées que seules les molécules de taille inférieure ou égale à 0.0005 µm sont susceptibles de diffuser à travers la membrane cellulaire des bactéries (Janning, 1998), or cette taille de molécules correspond approximativement à un poids moléculaire de 1.5 kDa (Erickson, 2009).

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Figure 7 : Schéma de synthèse du protocole analytique pour la caractérisation de la matière à différents temps de biodégradation

Phase soluble

HPLC

Cryobroyage À l’azote liquide

Extraction aqueuse

100°C 1H Tamisage Centrifugation

Phase non soluble Séchage à 38°C MO/ MS

HPLC NTK

CT/NT

CT/NT Van Soest x2

Matière brute (T0, T1, T2, T3, T4, Tf)

Protocole d’ensemble

MO /MS: analyse de la matière organique et matière sèche.

NTK: analyse de l’azote kjeldahl CT /NT: analyse carbone et azote total

HPLC: analyse sur HPLC Van Soest: analyse des fibres

MO/ MS

MO/ MS CT/NT

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