Méthodes d’analyse de l’OTA

Il existe différentes techniques permettant l’analyse de l’OTA à l’état de traces dans les aliments. Elles peuvent être divisées en deux catégories : les méthodes quantitatives comme les chromatographies en phase liquide ou gazeuse, basées sur la séparation chromatographique des molécules suivie de leur détection par fluorimétrie ou spectrométrie de masse, et les méthodes rapides de criblage comme les méthodes immunologiques [163]. I.2.6.1. Méthodes chromatographiques

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est la méthode la plus utilisée pour la détermination de l’OTA. Elle a pu être validée au niveau international et est actuellement retenue dans la plupart des méthodes officielles. Elle fait l’objet de normes françaises (Afnor), européennes (EN) et internationales (ISO). Des limites de détection basses (0,9 μg·kg-1 , 2,5 μg·kg-1 et 4,6 ng kg-1) ont pu être obtenues respectivement dans le blé et le maïs [164] et dans l’huile d’olive [142] grâce à un couplage à la spectroscopie de fluorescence. La combinaison de la HPLC avec la spectroscopie de masse seule (MS) ou en tandem (MS/MS) a également contribué à améliorer la quantification de l’OTA. Des résultats très reproductibles avec des limites de détection extrêmement basses (0,6 μg kg-1 dans les céréales [165] et 0,0065 μg l-1 dans le café [166]) ont pu être atteints.

La chromatographie gazeuse (GC) constitue également une méthode intéressante pour l’analyse des mycotoxines volatiles. Elle convient plutôt à la classe des trichothécènes [167] [168].

De manière générale, ces techniques sont extrêmement sensibles et permettent l'analyse de l’OTA avec une grande précision. Toutefois, elles ont aussi leurs limitations. Elles sont lourdes à mettre en œuvre. En outre, elles nécessitent beaucoup de manipulations, incluant le prétraitement des échantillons (extraction et purification). De plus, elles sont très coûteuses à l’achat, en fonctionnement et en maintenance et elles exigent un personnel qualifié.

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I.2.6.2. Méthodes immunochimiques

Les techniques immunochimiques reposent généralement sur l’utilisation d’un anticorps spécifique dirigé contre la molécule cible. Ces anticorps fixés sur un support inerte (tubes, puits, billes de verre, membranes) auront pour fonction de capturer les molécules de mycotoxines présentes dans le milieu réactionnel suite à une réaction d’interaction de type antigène-anticorps. La technique immunochimique la plus puissante est le test d’ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) [169]. Suivant la configuration de ce test, l’ajout d’un système enzymatique permettra de colorer le milieu réactionnel. La densité de la coloration mesurée sera proportionnelle ou bien inversement proportionnelle à la quantité de mycotoxine contenue dans l’échantillon. Le premier dosage immuno enzymatique de l’OTA dans des microplaques a été développé en 1981 par Pestka et al. [170]. Cependant, les réactivités croisées de l'anticorps par rapport aux autres ochratoxines n’étaient pas négligeables.

Depuis, différents types de kits d’ELISA ont été commercialisés pour la détection de l’OTA. Les kits les plus fréquents sont basés sur un format de dosage compétitif dans lequel l'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la liaison à l'anticorps. Le complexe formé va par la suite interagir avec un substrat chromogène afin d’obtenir un signal mesurable. La performance de cette technique a été comparée à la HPLC pour étudier la prévalence de l'OTA dans diverses denrées alimentaires telles que l’orge, le blé, l'avoine, le maïs, le riz et les raisins secs. Les résultats obtenus ont été trouvés proches [171].

Quel que soit l’échantillon à analyser, l’ELISA de type compétitif constitue une alternative rapide, spécifique et simple à utiliser. Un des inconvénients de ces kits vient du fait qu'ils sont à usage unique, ce qui peut augmenter les coûts de dépistage à grande échelle. Cette technique possède par ailleurs une plage de détection limitée en raison de sa sensibilité étroite aux anticorps. De plus, en raison de la petite taille de l’OTA, le développement d'anticorps nécessite l’intégration d'une molécule de support, généralement, une protéine, pour obtenir l'immunogénicité. Ce processus de conjugaison peut être responsable d’une baisse de sélectivité [172].

D’autres formes d’ELISA ont été appliquées dans le dépistage de l’OTA. L’ELISA direct, par exemple, a servi à détecter l’OTA et d’autres mycotoxines dans des produits alimentaires de consommation courante en Croatie, où une maladie rénale chronique atteignait des proportions très élevées. Les niveaux de contamination trouvés dans ces produits étaient en dessous de la limite légale maximale recommandée mais l’OTA a été signalé comme susceptible d'être un facteur de risque potentiel pour cette néphropathie [173]. D’une manière générale, la technique ELISA employée dans l'analyse de l’OTA, qu’elle soit directe ou indirecte, offre des avantages mais également des limites. L’ELISA direct est rapide puisqu'un seul anticorps est utilisé et la réactivité croisée de l'anticorps secondaire, observée dans certains cas, est complètement éliminée. Cependant, l'immunoréactivité de l'anticorps primaire peut être réduite à la suite de l'amplification du signal. L’ELISA indirect, par sa part, est généralement plus sensible. Chaque anticorps primaire contient plusieurs épitopes qui peuvent être liés par des anticorps secondaires marqués permettant ainsi l'amplification du signal. Cependant, dans ce cas, une réactivité croisée peut se produire avec les anticorps secondaires et provoquer l’apparition de faux positifs qui entraînent une

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surestimation des résultats [172]. Il est à signaler aussi que, comme toutes les autres méthodes, une étape de prétraitement de l’échantillon doit précéder l’analyse par ELISA.

Quelle que soit la méthode d’analyse évoquée précédemment, la matrice de l’échantillon constitue une forte contrainte surtout lorsqu’elle est complexe, comme c’est le cas de l’huile d’olive, matrice à base de matière grasse, à laquelle nous nous sommes intéressés dans ce travail.

La maîtrise de différents paramètres s’avère essentielle pour obtenir des résultats fiables tels que :

9 la pureté des solvants utilisés.

9 l'efficacité et la reproductibilité de l'étape d'extraction. 9 la limitation des étapes d'évaporation.

9 la résolution chromatographique. 9 la spécificité du détecteur. I.2.6.3. Biocapteurs

Parmi les autres techniques d’analyse des mycotoxines, en particulier de l’OTA, les biocapteurs ont été l’objet ces dernières années d’un intérêt particulier et apparaissent à présent comme des outils de screening à fort potentiel utilisables comme techniques complémentaires aux méthodes conventionnelles. Par ailleurs, leur rapidité de réponse, leur miniaturisation possible, leur facilité d'utilisation, leur faible coût et surtout leur haute sensibilité contribuent à la mise en place d’un système de dépistage fiable et simple.

Les aptacapteurs [160–173] et les immunocapteurs [174–182] sont les biocapteurs les plus généralement proposés pour la détection de l’OTA, quels que soient la matrice analysée ou le type de transducteur utilisé (optique [160-167, 174-176], électrochimique [168-173, 177-181] ou mécanique [182]). Toutefois, l’élaboration de ces biocapteurs est généralement fondée sur des architectures sophistiquées qui nécessitent l'emploi de composants coûteux, rendant difficilement envisageable la production en masse de ces dispositifs ainsi que leur utilisation pour l’analyse d’échantillons complexes et leur recyclage. Par comparaison, les enzymes ont été rarement exploitées, même si elles sont moins chères à produire et plus facile à manipuler. Des biocapteurs enzymatiques basés sur des processus d'activation ou d'inhibition ont été rapportés pour d’autres mycotoxines [174] mais à notre connaissance, un seul biocapteur à base d’enzyme a été proposé pour la détection de l’OTA [175,176]. Le mode de détection utilisé est électrochimique (la chronoampérométrie) et les échantillons analysés sont la bière et le café. Dans ce travail, nous avons évalué la possibilité d’utiliser des peptidases (carboxypeptidase Y et thermolysine) comme éléments de reconnaissance pour le développement d’un biocapteur conductimétrique pour l’analyse de l’OTA.

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