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Méthodes d‘analyse des biofilms

I. CHAPITRE I

I.10. Méthodes d‘analyse des biofilms

Il y a plusieurs méthodes pour analyser les biofilms. Ces méthodes sont groupées en techniques destructives avec lesquelles le biofilm est détruit après l‘application de ces techniques et d‘autres qui sont non destructives avec lesquelles le biofilm peut continuer son développement après l‘application de ces techniques. Nous présentons quelques méthodes de chaque groupe (Steven et al., 2000) :

I.10.1. Techniques destructives

I.10.1.1. Le comptage direct

C‘est la méthode classique, fondée sur la séparation des bactéries associées sur une surface, puis l‘évaluation du nombre et le type de microorganismes présents. Pour cela, plusieurs méthodes ont été proposées :

1- Sur une cellule de comptage sous un microscope avec ou sans coloration (Rogers et

al., 1994).

2- La cellule de Malassez (Hématimètre) : Il s‘agit d‘une lame dont l‘une des faces est creusée en carrés avec des dimensions connues. La suspension bactérienne est placée dans la cuvette puis recouverte d‘une lamelle. Des volumes précis est donc délimités au niveau des quadrillages dans lesquels les microorganismes sont comptés au microscope avec ou sans coloration. Le nombre compté est rapporté au volume délimité.

3- L‘ensemencement d‘un volume défini d‘échantillon sur milieu de culture gélosé (boîte de Pétri) permet, après incubation, de calculer la quantité de microorganismes viables cultivables des bactéries présentes dans l‘échantillon analysé. Le résultat est exprimé en Unités Formant Colonie par millilitre (UFC/ml).

Plusieurs procédés peuvent être appliqués pour désagréger les microorganismes de leur biofilm comme la sonication et l‘agitation avec des billes de verre.

I.10.1.2. Analyse d’ATP

Tous les microorganismes vivants contiennent de l'Adénosine TriPhosphate (ATP) qui peut être extrait et ensuite dosé avec l'enzyme Firefly-luciférase. La quantité de lumière produite par cette réaction enzymatique peut être mesurée et est liée directement à la quantité d'ATP et donc au nombre des cellules microbiennes (Blackburn et al., 1989). Cependant,

l‘usage de cette technique pour la quantification des biofilms dans les systèmes aquatiques peut être influencé par les métaux et les acides humiques qui interfèrent dans la réaction et qui perturbent l'interprétation des résultats. De plus, elle nécessite un prétraitement des cellules comme l‘extraction au DMSO diméthylsulfoxyde.

I.10.1.3. Cristal Violet

Le cristal violet (CV) est un colorant basique qui se lie sur les bactéries et les exo-polysaccharides dans la matrice extracellulaire du biofilm (Peeters et al., 2008). La coloration au CV a été initialement décrite par Christensen et al. (1985) et a été modifiée par Stepanovic et al., (2000) pour permettre la quantification de la biomasse de biofilm de faible épaisseur (âgés de quelques heures ou quelques jours). Du fait de la difficulté de la pénétration du CV dans un biofilm épais (quelques semaines voire quelques mois), cette méthode doit être modifiée pour être adaptée aux biofilms épais.

I.10.2. Techniques non destructives

I.10.2.1. Microscope optique

Le microscope est un instrument permettant d‘observer visuellement les petits objets généralement invisibles à l‘œil nu. L‘agrandissement angulaire et la résolution optique et numérique sont des propriétés qui influencent la performance du microscope (Herman et al., 1993). Le microscope a fourni une vaste gamme de méthodologies permettant de visualiser la morphologie de biofilm avec de nombreux objectifs (Henrici et al., 1932). Sous le microscope il y a deux modes d‘observations : la microscopie à fond clair permet d‘observer des échantillons colorés. En microscopie à fond noir, l‘image est créée par la diffraction de la lumière. Le microscope optique en mode fond noir a été utilisé par Lawrence

et al., (1989), en combinaison avec de l‘analyse d'image pour quantifier la cinétique de

croissance, la mobilité et le comportement des micro-organismes sur les surfaces.

I.10.2.2. Microscope confocal à balayage laser (MCBL)

Pour résoudre les défauts du microscope optique (notamment la difficulté de mise au point dans le cas d‘objets épais), la surface est éclairée par un rayon laser qui balaye la surface en positionnant un diaphragme (« pinhole en anglais») devant le détecteur. Ici il n'y a pas une image complète de l'échantillon. A chaque instant donné un seul point de

l'échantillon est observé et seuls les photons provenant du plan focal passent le diaphragme et participent à la formation de l‘image, d'où le nom confocal (mono focal).

La Figure I.19 montre le principe du microscope confocal à balayage laser. A chaque niveau horizontal à travers l‘épaisseur du biofilm, l‘appareil prend les informations et les regroupe pour former une image.

Le microscope confocal a une résolution un peu meilleure à l'horizontale qu‘en vertical. Pratiquement, la meilleure résolution horizontale d'un microscope confocal est d'environ 0,2 microns, et la meilleure résolution verticale est d'environ 0,5 microns (Prasad et al., 2007). Le microscope confocal à balayage laser offre plusieurs avantages par rapport aux microscopes optiques conventionnels. Il permet de (Caldwell et al., 1988):

- visualiser des structures complexes à fort grossissement.

- réaliser des coupes optiques à travers l'épaisseur de l‘échantillon dans les cas où les applications de microscopie traditionnelle sont limitées, ce qui permet des reconstructions en trois dimensions.

- visualiser simultanément plusieurs marqueurs fluorescents.

Des produits fluorescents ont été adaptés à la visualisation des microorganismes des biofilms : l‘acridine orange (AO) (Daley et al., 1975), l'iodure de propidium, (Jones et al., 1985), la rhodamine Rh 123 (Kaprelyants et al., 1992) et le chlorure de 5-cyano-2 ,3-ditoyl (CTC) (Rodriguez et al., 1992) sont souvent utilisés. Les couleurs de fluorescence obtenues avec l‘AO sont un reflet de la viabilité des cellules. Lors de la croissance, la quantité d‘ADN des microorganismes est supérieure à la quantité d‘ARN et la fluorescence des cellules est verte. En revanche, les cellules mortes ont peu d‘ADN et un haut contenu d'ARN ; la fluorescence est dans la partie jaune/orange de la gamme.

L‘ensemble des images permet de représenter la macrostructure du biofilm. Le traitement des images obtenues donne accès à la composition du biofilm en microorganismes et d‘autres composants intéressants.

X Z 30 Épaisseur Projection max X Z 30 Épaisseur Projection max Épaisseur Projection max

Figure I. 19 Principe de l‟étude du biofilm par MCBL. Le biofilm est scanné verticalement en tranches et chaque une est composée des points focaux. L‟ensemble forme une image 3D.

Il y a beaucoup d‘applications du microscope confocal dans le domaine des biofilms. Mohle

et al., (2007) ont montré que l‘épaisseur du biofilm dans les réacteurs RBC dépend de la

concentration du substrat. D‘autres études sont orientées vers l‘identification des microorganismes et leur activité biologique (Lewandowski and Beyenal, 2007).

La location des microorganismes du même groupe physiologique peut être détectée par la technique d‘Hybridation Fluorescente In Situ (FISH). Cette technique utilise les sondes oligonucleotides pour l‘hybridation des cellules et permet de visualiser les composants dans le corps de la cellule en liant avec les ribosomes et elle est considérée comme une méthode destructive. La Figure I. 20 montre des exemples (a) : les colonies de Staphylococcus aureus grâce à la fluorescence de sa propre protéine (YFP ou « yellow fluorescent Protein »). (b) : la distribution de bactéries oxydant l'ammoniac et de bactéries oxydant le nitrite dans un biofilm nitrifiant en utilisant la technique FISH (C) : l‘identification de bactéries Leptothrix

(a) : les colonies de Staphylococque

aureus en couleur jeune (verte claire).

(b) : deux types des colonies des bactéries rouges (oxydant l'ammoniac) et vertes (oxydant le nitrite) montrés par la techniques FISH dans un biofilm nitrifiante.

25 µm 25 µm

(C) : l‘identification de bactéries Leptothrix discophora en couleur verte dans un biofilm

Figure I. 20 Exemples de l‟application de microscopie confocale sur l‟étude des biofilms (a, b, c) (Lewandowski et Beyenal, 2007).

I.10.2.3. Microscopie à Force Atomique (MFA)

C‘est une forme de scanner utilisant une sonde fine (« pointe » de 10 nanomètres) pour suivre la topographie d'un échantillon et retranscrire les profils de la surface étudiée au niveau de l'atome (Goddard et al., 1993). La pointe produit soit une attraction causée par la force de Van des Waals, soit une répulsion. Ces forces provoquent des déplacements de la pointe, entraînant des déviations du levier qui sont enregistrées et traitées par ordinateur pour donner le relief à la surface. Il n'est pas limité en résolution comme le microscope optique (Hyde et al., 1997).

I.10.2.4. Microscopie électronique à balayage (MEB)

Elle est basée sur les interactions électrons-matière et consiste à envoyer un faisceau d‘électrons et balayer la surface de l‘échantillon. La réponse est la réémission de certaines particules (électrons secondaires, électrons rétrodiffusés) qui seront analysées par un détecteur permettant de reconstruire une image en haute résolution en trois dimensions (Woldringh et al., 1977 ; Chang et al., 1986). Les deux principaux inconvénients sont de devoir rendre l‘échantillon conducteur par dépôt d‘une fine couche d‘or (le plus souvent) et d‘opérer sous vide. Les microscopes électroniques à balayage les plus récents, dits « environnementaux » ne nécessitent pas de vide poussé (Danilatos, 1988).

I.10.2.5. Analyse d’images

L‘analyse d'image est l'extraction d'informations à partir des photos prises pour l‘objet étudié. C‘est un outil complémentaire des méthodes de visualisation par microscopie qui permet une quantification des informations que les images contiennent. Cette méthode est largement utilisée dans notre étude et nous consacrons plus d‘explications sur celle ci.

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