Le métabolisme du citrate chez la levure Yarrowia lipolytica

1. Description générale de Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica est une levure oléagineuse qui appartient à la famille des hémiascomycète

(Barth et Gaillardin, 1996, 1997). Elle a eu différentes appellations, Candida, Endomycopsis ou encore Saccharomycopsis lipolytica avant que le nom Yarrowia ne lui soit attribué par van der Walt et von Arx (van der Walt et von Arx, 1980) en hommage à David Yarrow (Yarrow, 1972) qui l’a isolée en 1970 (Nicaud, 2012). Les souches de Yarrowia lipolytica sont généralement isolées dans l’environnement ou des produits alimentaires. C’est le cas pour les souches isolées dans les milieux hypersalins ou milieux riches en lipides (Beopoulos et al., 2010; Thevenieau

et al., 2009). Le nom d’espèce lipolytica a d’ailleurs été attribué à cette levure en référence à sa

capacité à dégrader des quantités importantes de lipides (Nicaud, 2012; Papanikolaou et Aggelis, 2010). En industrie, les souches sont isolées des produits laitiers tels que les fromages et yaourts mais aussi sur des saucisses (Barth et Gaillardin, 1996; Fickers et al., 2005).

Y. lipolytica présente un fort potentiel sur le plan industriel par sa capacité à dégrader divers

substrats carbonés (glucose, glycérol et des alcools) (Fickers et al., 2005; Papanikolaou et al., 2006a) pour la production de lipides et acides organiques et protéines (Nicaud, 2012; Papanikolaou et Aggelis, 2010; Papanikolaou et al., 2006b). Cette levure aérobie stricte est considérée comme étant non-pathogène et la plupart des souches ne peuvent se développer dans des conditions de température supérieure à 32 °C (Nicaud, 2012). Elle a été classée GRAS

(Generally Recognized As Safe) par la FDA (Food et Drug Administration) américaine pour la production de citrate (Barth et Gaillardin, 1996; Fickers et al., 2005).

Trois souches sauvages de la levure Y. lipolytica sont reportées dans la littérature. Il s’agit des souches isolées par des équipes française (W29), allemande (H222) et américaine (CBS6124-2). Elles peuvent présenter un polymorphisme en fonction des conditions de culture et de variabilité génétique. Elles ont une forme arrondie caractéristique de la plupart des levures mais peuvent subir des transitions morphologiques et emprunter des formes mycéliales caractérisées par la formation d’hyphes (Fig. 11) (Barth et Gaillardin, 1997; Nicaud, 2012; Papanikolaou et Aggelis, 2010). La souche E150 issue du croisement entre les souches W29 et H222 a été totalement séquencée dans le cadre du projet Génolevures (Dujon et al., 2004). La connaissance du génome de Y. lipolytica a contribué à faire de cette levure non-conventionnelle un modèle d’étude des variations morphologiques mais aussi de la respiration cellulaire (Brandt et al., 2005).

Figure 11 : La morphologie de Yarrowia lipolytica dans deux conditions de cultures.

(A) forme levure classique lors d’une croissance sur le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base). (B) forme filamentaire après ajout d’un sérum (Nicaud, 2012).

2. La respiration chez Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica est aérobie stricte et présente une chaîne de transfert des électrons proche

des cellules animales (Brandt et al., 2005; Nicaud, 2012). Elle a donc été proposée comme modèle pour l’étude du rôle du complexe I de la chaîne respiratoire et l’apparition de certaines pathologies humaines (Brandt et al., 2005; Kerscher et al., 2004). La chaîne respiratoire de Y.

lipolytica est semblable à celle présentée dans le chapitre 2, avec la présence des cinq complexes

(I-V). Cependant, il existe quelques différences, notamment par la présence de complexes rédox « alternatifs » proches de ceux présents chez les plantes et les champignons (Guerrero-Castillo

la surface externe de la membrane mitochondriale et d’une oxydase alternative (AOX) présente sur la surface interne (Kerscher, 2000; Kerscher et al., 2002a). La spécificité de ces deux oxydo-réductases est qu’elles ne participent pas à la création de la force proton-motrice (Guerrero-Castillo et al., 2011, 2012; Joseph-Horne et al., 2000). Des études ont montré que les protéines NDH2e et AOX interagissent avec différents complexes de la chaîne respiratoire, en fonction des conditions de culture et de la phase de croissance. En phase de croissance, NDH2e formerait un supercomplexe avec les complexes III et IV de la chaîne respiratoire (Guerrero-Castillo et al., 2009). En phase stationnaire, NDH2e et AOX forment un complexe dissocié des autres complexes et de la chaîne classique de transfert des électrons. Ce mécanisme d’association/dissociation ou couplage/découplage de la NDH2e à la chaîne respiratoire a été proposé comme un mécanisme de défense, aussi présent chez les plantes, face à un stress. Il a été reporté que le découplage de la respiration chez Y. lipolytica limite la production d’espèces oxydantes telles que les ROS (Reactive Oxygen Species) (Guerrero-Castillo et al., 2012). Cette réponse antioxydante par la respiration alternative a été mis en évidences chez d’autres levures aérobies strictes (Guerrero-Castillo et al., 2011). Elle a été proposée comme un mécanisme plus global qui maintiendrait la respiration mitochondriale par l’intermédiaire de l’AOX et participe aussi à la fermentation aérobie en phase stationnaire (Martínez-Cárdenas et al., 2018). Par ailleurs, il a été mis en évidence des sites de régulations chez l’AOX par des nucléotides et acides organiques chez les plantes (Hoefnagel et al., 1995; Millar et al., 1993) et potentiellement chez Y. lipolytica (Guerrero-Castillo et al., 2012; Luévano-Martínez et al., 2010).

3. La respiration alternative chez Yarrowia lipolytica et l’overflow de citrate

Une étude récente sur l’activité respiratoire chez Phaffia rhodozyma, a mis en évidence un mécanisme commun entre l’activité de l’AOX et le phénomène d’overflow métabolique

caractérisé par production d’éthanol chez cette levure (Martínez-Cárdenas et al., 2018).

P. rhodozyma est connue pour sa capacité à accumuler de l’astaxanthine, un antioxydant de la

famille des caroténoïdes, en condition de stress afin de protéger la cellule contre les ROS. Le mécanisme global de production des ROS, de l’astaxanthine et de l’AOX est synthétisé dans la figure 12. Ce mécanisme est-il transposable à Y. lipolytica pour expliquer la production de citrate ?

Figure 12 : Mécanisme proposé par Martínez-Cárdenas et al., 2018 pour expliquer l’overflow d’éthanol, la synthèse d’antioxydants et l’expression de l’oxydase alternative chez Phaffia rhodozyma.

Une perturbation de la respiration mitochondriale par mutation, hypoxie, déficience en cuivre ou ajout d’inhibiteur (Antimycine A) et l’accumulation d’espèces réduites (NADH et QH2) favorisent une augmentation de ROS. Ainsi la fermentation aérobique ou anaérobique ainsi que la synthèse de l’antioxydant astaxanthine et l’expression de l’AOX seraient des stratégies pour limiter l’accumulation des ROS.

4. Mécanisme général pour expliquer la production de citrate chez Yarrowia

lipolytica

Yarrowia lipolytica est connue pour sa capacité à accumuler de grandes quantités de lipides et

acide citrique en phase stationnaire de croissance (Papanikolaou et al., 2006b; Ratledge et Wynn, 2002; Rattray et al., 1975). L’explication donnée pour ces accumulations successives de lipides puis citrate est la diminution de l’AMP intracellulaire (Ochoa-Estopier et Guillouet, 2014; Papanikolaou et al., 2006a; Ratledge et Wynn, 2002). L’AMP est un activateur de l’aconitase, une enzyme du cycle de Krebs responsable de l’oxydation du citrate en isocitrate. Lors d’une carence en azote, en début de phase stationnaire, l’AMP devient une source en azote pour la cellule. L’AMP est clivée en IMP et NH3 sous l’action de l’AMP désaminase (Ratledge et Wynn, 2002). L’aconitase est alors inhibée et provoque une accumulation de citrate dans la mitochondrie. Le citrate mitochondrial accumulé est transporté dans le cytosol puis clivé à son tour par l’ATP citrate lyase en oxaloacétate et acétyl-CoA, un précurseur pour la synthèse des lipides. La plupart du temps, l’accumulation de lipides est limitée (mécanisme non-identifié) et le surplus de citrate est excrété dans le milieu de culture.

Comme expliqué plus haut, la NADH dehydrogenase de type II (NDH2e) et l’oxydase alternative (AOX) limiteraient la production des ROS (reactive oxygen species) lors de la phase stationnaire de croissance(Guerrero-Castillo et al., 2012). Les auteurs ont utilisé des inhibiteurs de la chaîne respiratoire (antimycine A, roténone, cyanure (KCN)), un agent découplant (CCCP) et un inhibiteur de l’AOX (n-propylgallate (nPG)) pour étudier la respiration en phases de croissance et stationnaire chez Y. lipolytica. La consommation en oxygène (JO2) est principalement inhibée par le cyanure en phase exponentielle de croissance lorsqu’un apport important en ATP est requis. Inversement, la JO2 est plus inhibée par la nPG en phase stationnaire, ce qui met en évidence l’activation de l’AOX en phase stationnaire. La question qui se pose est le rôle potentiel joué par la respiration alternative dans la production de citrate chez Y. lipolytica. Très peu d’études récentes sont répertoriées concernant l’activité respiratoire et la production de citrate chez Y. lipolytica. Le seul article identifié date de 1979 par Akimenko

et al., disponible sous forme d’abstract (Akimenko et al., 1979). Les auteurs ont étudié la

relation entre la respiration résistante au cyanure (NDH2e-AOX) et la production de citrate chez différentes souches de l’espèce Candida (Yarrowia) lipolytica. La production de citrate est reportée comme étant inversement proportionnelle à la respiration résistante au cyanure. La surproduction de citrate serait observée lors de l’inhibition complète de la respiration par le cyanide. D’autres études plus récentes ont permis d’identifier la fonction principale de la respiration alternative chez Y. lipolytica. Medentsev et al. (2002) ont utilisé le FCCP (un agent découplant de la phosphorylation oxydative) en combinaison avec le cyanure pour inhiber la respiration mitochondriale. Le système NDH2e-AOX aurait pour fonction la récupération du surplus d’électrons qui traversent la chaîne respiratoire et limiter la production des ROS.