a) Principe et Définition
Le TCR permet aux lymphocytes T de reconnaître l'antigène de façon spécifique présenté sous forme peptidique par les molécules du MHC des cellules présentatrices [Zinkernagel ; 1974]. Ainsi, l'utilisation d'un complexe MHC-peptide donné sous forme soluble devrait permettre de repérer l'ensemble des lymphocytes T qui lui sont spécifiques quelque soit leur état fonctionnel. Toutefois, du fait de la faible avidité des TCR pour leur ligand, les complexes MHC-peptides sous forme monomérique ne se fixent pas sur les lymphocytes T [Valitutti ; 1995]. C’est en 1996 que l’équipe d’Altman et coll. a résolu ce problème en utilisant des formes tétramériques de complexes MHC-peptides, augmentant ainsi l'avidité du système (Figure XXVI) [Altman ; 1996].
Figure XXVI. Description et développement des tétramères MHC classe II. Les molécules de MHC classe II recombinantes sous formes monomériques sont produites en incorporant des motifs leucine zipper à la place des domaines transmembranaires et cytosolique originaux pour stabiliser le complexe / . Ces molécules sont produites dans des cellules de Drosophile tranfectées stablement. Elles sont ensuite purifiées par chromatographie d’affinité et biotinylées sur la portion N-terminal de la chaine du MHC classe II. Les monomères chargés sont ensuite assemblés sous forme tetramerique par l’addition de la streptavidine qui possède 4 sites de liaisons pour la biotine. L’utilisation d’une streptavidine couplé à un fluorochrome (typiquement la Phycoerythrine) permet alors la détection par cytométrie en flux de la liaison du téramère sur la cellule T CD4+ dont il est spécifique. (Adapté de [Mallone ; 2004])
Les tétramères MHC, en mimant l’action d’une cellule présentatrice d’antigène, permettent d'identifier directement l'ensemble des lymphocytes T spécifiques d'un complexe MHC-peptide donné au sein des lymphocytes circulants.
b) Des tétramères classe I aux tétramères classe II
Le développement des tétramères MHC classe I, a fortement complété et modifié notre compréhension des réponses lymphocytaires T CD8+ MHC classe I restreinte au cours d’infections virales et bactériennes [Doherty ; 1998] [Busch ; 1998] [ White ; 1999] [ Kim ; 2000]. Le développement plus complexe des tétramères MHC classe II pour l’analyse des réponses T CD4+ est apparu peu de temps après chez la souris [Crawford ; 1998]. Son utilisation chez l’homme fut plus laborieuse à cause de la faible fréquence de cellules T CD4+ spécifiques [Novak ; 1999] [Meyer ; 2000]
[Mallone ; 2004]. Depuis, de récentes avancées ont permis de surmonter ces limites permettant l’utilisation des tétramères MHC classe II dans de multiples domaines [Voller ; 2008]. A l’heure actuelle, les nouveaux défis pour une accroitre l’utilisation de la technologie tétramère MHC classe II se concentrent sur la production des différents variants alleliques des molécules MHC classe II et sur la détermination des épitopes immunodominants de chaque antigène d’intérêt. Ce dernier point sera détaillé dans la partie « identification des épitopes T immuno-dominants.
c) Avantages/Inconvénients Les avantages
L’utilisation des tétramères MHC ne nécessite pas de manipulation au préalable pour identifier les cellules T spécifiques de l’antigène. Cet outil présente ainsi le principal avantage de fournir une analyse directe hautement spécifique, sensible et facile des cellules T spécifiques. Il permet également de déterminer la fréquence des cellules T spécifiques présents dans le sang périphérique (Tableau IX). L'utilisation des tétramères MHC permet une analyse fine des réponses T spécifique de l’antigène lorsqu’il est couplé avec d’autres analyses phénotypiques ou fonctionelles lors d’une analyse multiparamétrique [Klenerman ; 2002]. De plus, les cellules tétramères positives sont viables et peuvent être triées pour réaliser des analyses complémentaires comme l’analyse de l’expression génique par PCR quantitative, ou l’analyse du répetoire T. Cette technologie offre ainsi des informations complémentaires
aux autres méthodes d’analyse des réponses T spécifiques. Il devient par conséquent un outil biologique standard incontournable dans l’étude des réponses T spécifiques.
Les inconvénients
L’une des limites de l’analyse par les tétramères MHC classe II est la fréquence souvent très faible des cellules CD4+ spécifiques d’un épitope T. Ceci implique dans bien des cas une phase d’expansion in vitro [Lemaitre ; 2004] [Scriba ; 2005]. Cette étape permettant d’amplifier les cellules T CD4+ spécifiques de l’antigène complique la détermination de la fréquence initiale de ces cellules, qui bien souvent constitue l’un des buts de ce type d’analyse. De plus, des changements potentiels du phénotype des cellules T amplifiées et la perte des clones non répondeurs peuvent être générés au cours de cette étape. Une autre contrainte est la nécessité d’avoir identifié l’épitope immunodominant. De plus cette analyse se limite à un épitope donné, qui peut ne pas être représentatif de la réponse globale dirigée contre l’allergène. Un autre inconvénient est le haut polymorphisme des molécules MHC classe II. Ceci restreint alors l’analyse aux individus présentants un haplotype MHC classe II (allèles DRB1 principalement) pour lesquelle sont disponible les tétramères MHC classe II [Voller ; 2008]. C’est pourquoi la plupart des études utilisant les tétramères MHC classe II chez l’homme sont restreintes aux molécules HLA les plus répandues (Tableau IX).
Tableau IX : Pourcentage de différents allèles DRB1 dans des populations caucasiennes, africaines et asiatiques. (Adapté de [Colombani, 1993]) Abréviations: FRA: France, DAN: Danemark, GER: Allemagne, ITA: Italie, ROU: Roumanie, SPA: Espagne, US: Etats-Unis, CAN: Canada, SEN: Sénégal, JAP: Japon.
Outils Caractéristiques Avantages Inconvénients ELISPOT Mesure des cellules T
spécifiques ayant sécrétées
* Bruit de fond possible par effet
« by-stander »
* Ne permet pas une analyse multiparamétrique
* Ne permet pas une analyse des marqueurs de surfaces
ICS Mesure des cellules T spécifiques ayant
* Analyse sur cellules fixées et pérméabilisées
* Analyse difficile des marqueurs de surface
CFSE Mesure de la prolifération des cellules par dilution du
* Peut être suivie d’une étape de purification
* Manque de sensibilité
* Se limite à la détection des cellules ayant répondu à la
stimulation
CSA Mesure des cellules T spécifiques ayant sécrétées des cytokines en réponse à
un stimulus
* Peut être suivie d’une étape de purification
* Bruit de fond possible par effet
« by stander »
CD154 Mesure des cellules T spécifiques par détection
* Peut être suivie d’une étape de purification
* Peut être suivie d’une étape de purification
* Se limite aux individus ayant une restriction MHC-classe II identique aux tétramères utilisé.
* Coûteux
Tableau X. Caractéristiques et avantages/inconvénients des différents outils biologiques d’analyses des réponses T spécifiques de l’allergène. (Adapté de [Kern ; 2005])