4. MATERIEL ET METHODES
4.10. Les paramètres d’élevage
La productivité aquacole est ainsi étroitement liée, d’une part à la qualité hydrobiologique du milieu défini par ses paramètres physiques, chimiques et biologiques (classiques en océanographie) qui influent sur la reproduction et sur la croissance des espèces, d’autre part à certains facteurs altéragènes tels que micro-organismes et toxiques divers affectant la consommabilité des produits (Gibert B., 1989 Barnabe, G., 1991).
4.10.1. Les paramètres physico-chimiques de l’eau
La croissance des crevettes dépend de la valeur de chaque paramètre physico-chimique. Le diagnostic du milieu d’élevage se fait donc par la mesure des paramètres suivant : la température, la salinité, le pH, la turbidité de l’eau et l’oxygène dissous. Le contrôle de la turbidité par le disque de Secchi est volontairement omis. Cette mesure informe seulement la densité du bloom traduit par la transparence. Une transparence qui ne distingue pas la dominance des bonnes ou des mauvaises algues. La mesure est suppléée alors par l’évaluation de la couleur d’eau qui renseigne beaucoup plus sur l’aspect qualitatif.
4.10.1.1. Température
La température est un des facteurs environnementaux les plus importants pour tous les organismes aquatiques : elle agit sur l’oxygénation des eaux, la productivité primaire source de nourriture pour les élevages en mer ouverte, la reproduction et la croissance des espèces ( Gibert B., 1989 Barnabe, G., 1991).
Pendant l’élevage, la mesure de la température s’effectue deux fois par jours : le matin vers 07h00 et l’après midi vers 15h30, à l’aide d’un appareil multi paramètres de marque WTW Multi 340i.
4.10.1.2. Oxygène dissous
Parmi les gaz dissous, l’oxygène est celui qui joue le rôle le plus important pour la qualité biotique des eaux d’élevage ; indispensable à la respiration des organismes, il facilite la dégradation des matières organiques détritiques et l’accomplissement des cycles biochimiques ( Gibert B., 1989 Barnabe, G., 1991). L’oxygène présent dans les eaux est le résultat des échanges entre l’atmosphère et la surface de l’eau ainsi que de l’activité photosynthétique du phytoplancton. Sa solubilité dans l’eau est limitée et atteint une valeur maximale appelée taux de saturation qui dépend inversement de la température et de la salinité.
Sa mesure se fait deux fois par jour durant l’élevage : le matin vers 07h00 et l’après midi vers 15h30, toujours à l’aide d’un appareil multi paramètres de marque WTW Multi 340i. On mesure la teneur en oxygène dissous en profondeur des bassins.
4.10.1.3. Salinité
De manière générale, la salinité joue un rôle sur la reproduction (gamétogenèse et tolérance des larves aux milieux euryhalins), la nutrition et la croissance des organismes, cette dernière étant optimal dans une fourchette restreinte de salinité et dépendant des espèces considérées. (Gibert B., 1989 Barnabe, G., 1991). Le grossissement des crevettes et la productivité naturelle sont conditionnés pour une grande part par la salinité des eaux d’élevage (Olivier A.
et al., 2003).
La mesure de ce paramètre s’effectue deux fois par jours : le matin vers 07h00 et l’après midi vers 15h30, à l’aide d’un appareil multi paramètres de marque WTW Multi 340i, il suffit de changer la sonde pour mesurer la valeur de la salinité. La mesure se fait en surface.
4.10.1.4. pH
La mesure est effectuée également deux fois par jour : le matin vers 07h00 et l’après midi vers 15h30 à l’aide d’un pH-mètre de marque Cyberscan Waterproof. Cet appareil indique directement la valeur du pH de l’eau de surface.
4.10.2. Les paramètres biologiques
Ces paramètres devraient être vérifiés régulièrement pendant l’élevage car ils ont rapport à la nutrition. Ce sont le phytoplancton et le zooplancton. Par définition, le plancton est constitué par l’ensemble des organismes vivants végétaux (phytoplancton) et animaux (zooplancton) qui flottent dans les eaux. Il est surtout abondant dans les eaux de mer, dans les lacs, dans les marais, dans les eaux courantes et dans les eaux thermales (Duran J. R. et Leveque C., 1980). Le phytoplancton est composé des algues telles les diatomées, les chlorophycées, les flagellées, les dinoflagellés et les cyanobactéries. Le zooplancton comprend des animaux comme les copépodes, les rotifères, les foraminifères, etc…
Le plancton joue un rôle important sur la vie des crevettes :
les activités métaboliques dans l'eau sont rendues possibles grâce à la production d'oxygène et l’utilisation de bioxyde du carbone par les algues pendant la photosynthèse.
le phytoplancton constitue le premier maillon de la chaîne trophique assurant une source alimentaire pour les zooplanctons. Ces derniers représentent une nourriture de base préférentielle pour les post larves et les juvéniles.
l’algue intervient dans des cycles biochimiques importants, en particulier, le cycle de l’azote du bassin favorisant ainsi l’élimination des déchets azotés.
le bloom empêche la lumière d’atteindre le fond du bassin limitant le stress des animaux et réduisant le développement d’algues benthiques
Au niveau du bassin, l’état du bloom phytoplanctonique est contrôlé quotidiennement par l’intermédiaire de la couleur de l’eau, de la turbidité, et de la teneur en oxygène.
Observation de la couleur de l’eau marron ou jaune vert (bon bloom)
brun sombre, fluorescent la nuit (bloom vieillissant) laiteux (chute de bloom)
Contrôle de la turbidité (faible teneur des particules en suspension)
>45 cm à transparent (bloom pauvre)
40 – 45 cm (bon bloom si la couleur est bonne) 35 –40 cm (bon bloom)
<30 cm (boom trop fort) Teneur en oxygène matin après-midi
4-5 6-7 bloom pauvre si récent 4-6 7-9 bon bloom
1-3 10-15 bloom trop fort 3-5 4-5 vieux boom
4-6 2-4 chute du bloom
Ainsi le but de l’étude est d’avoir de l’information quantitative et qualitative du plancton et son évolution au cours de l’élevage.
4.10.2.1. Plancton
Les prélèvements ont été réalisés durant l’élevage tous les quinze jours sur chaque bassin d’élevage.
a- Prélèvement en surface
Cette méthode consiste à faire l’inventaire du plancton dans le bassin. Les prises du plancton ont été faites à l’aide d’un filet pélagique constitué de soie à bluter de maille égale à 20 micromètres et dont le diamètre d’ouverture est de 19,5cm (Figure 24). On a tiré le filet suivant la longueur du bassin (20m) de manière à ce qu’il immerge à 50 cm de profondeur. Avant de remonter le filet, il faut le remplir avec de l’eau et en même temps effectuer des mouvements de bas en haut pour que l’eau entraîne le plancton vers le cul du filet. Pour chaque bassin, on a préparé des piluliers de 50ml. On a pris le cul du filet en le tournant comme une chaussette au dessus du flacon (de 500ml) rempli à moitié d’eau filtrée du bassin. On immerge le fond du filet dans le flacon en remuant doucement avec le doigt de façon à détacher le plancton sur les parois du filet. On verse ensuite 20ml d’eau dans les piluliers, il faut homogénéiser l’eau avant de la verser dans les piluliers. A la fin du prélèvement, les échantillons sont fixés avec une dilution de 5% de lugol (quatre gouttes sur chaque pilulier). On peut utiliser également du formol neutralisé à 5% comme fixateur mais il est conseillé d’utiliser le lugol qui ne présente aucune conséquence sur les espèces planctoniques. (Voir annexe 7: photos résumant les différentes étapes)
b- Prélèvement en profondeur
Ce prélèvement va servir au comptage du plancton dans chaque bassin.
L’échantillonnage est fait à l’aide d’une bouteille de prélèvement à clapets type Niskin de 7,5 litre de capacité. Il s’agit d’un cylindre, ouverts aux deux extrémités et muni de systèmes de fermeture. La bouteille a été ténue verticalement pendant quelques minutes au fond du bassin, avant de glisser le messager pour fermer la bouteille (Figure 25). L’eau dans la bouteille est ensuite filtrée à l’aide d’un filet à plancton de maille égale à 20 micromètres
et le contenu du fond est ensuite versé dans un flacon rempli à moitié d’eau filtrée. 20ml de l’échantillon est conservé dans le pilulier et fixé avec du lugol neutralisé à 5% à raison de 4 gouttes par pilulier. (Voir annexe 8: photos résumant les différentes étapes)
Bouteille de prélèvement à clapets du type Niskin ouvert
Bouteille de prélèvement à clapets du type Niskin fermé
Figure 25 : Bouteille de prélèvement d
L
c
Soie à bluter Légende :
c : collecteur
d : diamètre de l’ouverture L : longueur
Figure 24 : Filet à plancton
c- Prélèvement des sédiments meubles
Le sédiment est prélevé à l’aide d’une seringue à l’extrémité tronquée (Figure 26). Le volume d’échantillon est de 5ml. L’échantillon ainsi prélevé a été mis directement dans un pilulier de 50ml de volume total. La dilution est faite avec 20ml d’eau de mer filtrée par le filet à plancton pour éviter l’interférence d’autres espèces contenues dans l’eau de mer. On a ensuite ajouté du lugol pour fixer les espèces planctoniques dans l’échantillon.
4.10.2.2. Observation et comptage a- Observation
Avant toute opération, il faut homogénéiser l’échantillon dans le pilulier.
Pour chaque observation, une goutte d’échantillon fixé (environ 0,05ml) a été montée entre lame et lamelle à l’aide d’une pipette graduée. Au moins trois observations sous microscopes ont été réalisées. La détermination des espèces a été effectuée sous microscope renversé avec lequel on peut voir nettement les ornementations et la forme des cellules. Les espèces rencontrées dans chaque prélèvement ont été notées.
b- Comptage
On dénombre le plancton observé dans une goutte d’échantillon. La même opération est répétée 10 fois et on calcule ensuite le nombre moyen d’individus par goutte. Puis, ce nombre moyen par goutte est converti en nombre moyen par ml, par 20ml (volume de l’échantillon dans le pilulier) et enfin par 240m3 ou 240.000 litre ou 240.000.000 ml (volume du bassin).
Figure 26: Prélèvement des sédiments meubles
Remarques :
- Pendant le comptage, les individus incomplets ou rompus ne sont pas considérés ;
- Quand on change d’échantillon, la pipette et les lames / lamelles sont abondamment rincées.
Les espèces facilement reconnaissables sont identifiées immédiatement au moment de l’observation. Pour les espèces plus difficiles à identifier, on s’est référé à des ouvrages de références comme ceux de Heinz Streble et Dieter Krauter, 2002 ; Lope J. C., 1997. Néanmoins, certaines espèces restent indéterminées.
4.10.3. Les nutriments minéraux dissous
Les éléments nutritifs sont des descripteurs hydrologiques indispensables à l’étude ou la caractérisation d’un écosystème marin (Aminot A. et Kérouel R., 2004).
Indirectement, ils peuvent avoir des répercussions sur les activités humaines car leur disponibilité conditionne la production primaire sur laquelle se développe ensuite l’ensemble de l’activité biologique du milieu. Les éléments nutritifs sont aussi présents dans le milieu aquatique sous diverses formes organiques en solution ou dans le matériel particulaire. Les nutriments minéraux dissous tels que l’ammonium, l’ammoniac (azote ammoniacal), le nitrite (azote nitreux), le nitrate, le phosphate et le silicate sont parmi ces éléments nutritifs dans l’eau. Dans la présente étude un échantillonnage a été fait tous les quinze jours dans le but d’analyser trois éléments minéraux à savoir l’ammonium, le phosphate et le silicate.
4.10.3.1. Prélèvement
Le prélèvement s’effectue toujours à l’aide de la bouteille de prélèvement à clapets de type Niskin dans chaque bassin tous les quinze jours. On met ensuite le contenu de la bouteille dans un flacon plastique d’un litre de couleur noir et on l’amène au laboratoire ou l’on va faire la filtration.
4.10.3.2. Filtration
Pour sélectionner les substances dissoutes par opposition au matériel particulaire, il est convenu de d’effectuer une filtration sur une membrane de 0,5µm (Aminot A. et Kérouel R., 2004).
Pour éliminer les organismes vivants susceptibles de consommer ou de sécréter des nutriments, il serait nécessaire d’effectuer la filtration avec des membranes à 0,2µm qui retiennent les plus petites cellules (Figure 27). Pour être efficace, cette filtration devrait être effectuée très rapidement après le prélèvement.
Pour empêcher les interactions physico-chimiques pendant l’analyse chimique, l’élimination des particules est indispensable. Ce point concerne tout particulièrement le phosphate, mais dans ce cas, les particules peuvent être éliminés par centrifugation juste avant l’analyse (Kérouel & Aminot, 1987).
En pratique, l’utilisation d’une membrane de 10µm de porosité est un bon compromis entre le taux d’élimination du phytoplancton (Bougis P., 1974). Les fibres les plus couramment utilisées sont les fibres en esters de cellulose et en fibre de verre. Pour notre cas, on s’est servi du dernier : fibre de verre Whatman GF/F. Leur porosité nominale est voisine de 0,7µm mais ils ont une bonne capacité de rétention des particules. Pour l’analyse de silicate, on a pris 50ml d’échantillon pour chaque bassin que l’on a empoisonné directement sans être filtré. Ensuite, 500ml d’échantillon à été filtré pour chaque bassin pour l’analyse de phosphate et ammoniac. Il faut retenir que pour obtenir un ensemble de données cohérentes et des résultats comparables, il est recommandés de filtrer autant que possible des volumes du même ordre de grandeur pour tous les échantillons de matériel particulaire (Sharp J.H., 1974).
4.10.3.3. Empoisonnement des échantillons
300 ml d’échantillon filtré de chaque bassin a été empoisonné avec 300µm de poison avant de le diviser dans deux flacons plastiques différents : 50ml pour l’analyse de phosphate et 250ml pour l’analyse de l’ammonium. Le poison utilisé était le mercure dilué. L’utilisation du chloroforme est déconseillé car non seulement il cause une libération de phosphate cellulaire dans les échantillons non filtrés (Jones P.G.W., 1963 ; Fitzgerald G.P.& Faust S.L., 1967) mais en tant que source de carbone pour certaines souches bactériennes, ils peuvent
Figure 27: Appareil pour la filtration
Entonnoir contenant l’échantillon à filtrer ainsi que le filtre (en bas)
Echantillon filtré
favoriser la consommation d’azote et du phosphore (Castellvi J. & Cano M., 1983).
4.10.3.4. Conservation
La congélation est une technique simple pour « figer » l’état de l’échantillon par arrêt de tous les processus qui se déroulent normalement dans le milieu liquide, qu’ils soient physico-chimiques ou biologiques. Utilisée depuis 1950, la congélation a fait l’objet de nombreux travaux quant à sa capacité à préserver les nutriments inorganiques dissous. Depuis, il a été prouvé que la congélation est une méthode satisfaisante, au moins sur des durées de 5 à 6 mois pour tous les nutriments en eau douce comme en eau de mer (Clementson L.A. & Wayte S.E., 1922 ; Avanzino R.J. & Kennedy V.C., 1993 ; Dore J.E. & al., 1996).
Après chaque prélèvement, filtration et empoisonnement, on a congelé à -20°C les échantillons à l’exception de ceux qui sont prévus pour l’analyse du silicate qui ont été réfrigéré car la congélation engendre une formation de polymères d’autant plus marquée que la salinité est faible (Dore J.E. et al., 1996).
4.10.3.5. Mesure de la concentration en silicate
Le terme « silicate » est employé ici pour designer les formes dissoutes de l’ion orthosilicique, Si(OH)4, le silicate dissous est fréquemment exprimé sous cette forme. Le Silicium est un élément nutritif car il entre dans la composition des squelettes de certaines espèces phytoplanctoniques (diatomées, radiolaires,…).
Selon Jean P. et Michel C., 1994, le besoin en silice varie d’une espèce à l’autre mais également au sein d’une même espèce, selon son stade de développement. Certaines espèces faiblement silicifiées se développent normalement en présence de faible quantité de silice. D’autres plus fortement silicifiées, requièrent des concentrations en silice plus importantes et peuvent présenter des formes anormales si la silice devient un élément limitant.
L’analyse est effectuée selon la méthode de Mullin J. B., et Riley J.P., (1955) adaptée par Strikland J.D.H. et Parsons T.R., (1972).
a- Matériel
On doit disposer d’un spectrophotomètre ou d’un colorimètre muni d’un filtre ayant un maximum de transmission à 810 nm environ.
L’utilisation de fioles jaugées en plastique de 100ml est tout à fait indiquée pour éviter la contamination des étalons par le verre.
Le volume des échantillons à analyser devrait être mesuré à l’éprouvette graduée en plastique ou directement dans le flacon marqué au volume.
Pour de grandes séries, il est intéressant de prévoir des distributeurs répétitifs manuels en plastique pour les réactifs (par exemple : Multipette Eppendorf).
Concernant le flaconnage, les flacons d’échantillonnage ne doivent pas à priori être considérés comme exempts de traces de nutriments. Les contaminations par le matériau du flacon sont spécifiques au silicate et au phosphate si les échantillons sont conservés en flacon de verre (Aminot A. et Kérouel R., 1995a).
b- Réactifs
On doit utiliser des produits de pureté « pour analyse » et de l’eau déminéralisée de haute qualité, fraîchement soutirée. L’eau déminéralisée de haute qualité peut être utilisée comme eau « pure » exempte de silicate.
Cependant toute eau déminéralisée peut contenir des traces de silicate si les résines ont été utilisées sur une longue période (Hansen H.P. et Koroleff F., 1999). La comparaison régulière de blancs réalisés avec différentes eaux déminéralisées est conseillée.
Les réactifs doivent être préparés dans des récipients de plastique (sauf H2SO4 4,5 m/l).
Il y a trois sortes de réactif :
Réactif 1 : solution acide de molybdate. Dissoudre 15g d’heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté avec environ 25ml d’eau déminéralisée dans une fiole de 100ml, ajouter 25ml d’acide sulfurique 4,5 M. Après dissolution, compléter le volume.
Conservée en flacon de plastique, à l’abri de la lumière, cette solution est stable plusieurs mois à température ambiante.
(Pour 1 litre de solution d’acide sulfurique 4,5 M, prendre 250ml d’acide sulfurique concentré dans environ 750ml d’eau déminéralisée, compléter le volume après refroidissement)
Réactif 2 : solution d’acide oxalique. Dans 100ml d’eau déminéralisée, dissoudre 10g d’acide oxalique (la solution est saturée). Conservée en flacon de plastique, cette solution est stable indéfiniment à température ambiante.
Réactif 3 : solution d’acide ascorbique. Dans 100ml d’eau déminéralisée, dissoudre 2,8g d’acide ascorbique. Conservée au
réfrigérateur, cette solution est stable plusieurs semaines. La renouveler si elle brunit.
c- Mode opératoire
Préparations des étalons
Un étalonnage de six niveaux de concentration (2,5µmol / 5µmol / 10µmol / 25µmol / 50µmol et 100µmol) a été fait pour vérifier la linéarité de la réponse dans la gamme de travail.
La solution étalon S1 (ou solution mère) de silicate à 5 000 µm/l à été obtenu en mélangeant 0,9403g d’hexafluorosilicate avec environ 300 ml d’eau déminéralisée dans un bécher. Placer sous agitation magnétique jusqu'à dissolution complète. Transférer dans une fiole de 1 000 ml en rinçant plusieurs fois le bécher et ajuster le volume. Cette solution se conserve plusieurs années à température ambiante et à l’abri de la lumière, sous réserve d’éviter l’évaporation (Aminot A. et Kérouel R., 1996)
Préparer la solution n°2 (S2) à partir de S1. On connaît : C2= 500 µmol/l (concentration de la solution n°2),
V2= 100 ml (volume de la solution n°2 à préparer) et C1= 5 000 µmol/l. Il reste à déterminer V1?
C1 x V1 = C2 x V2, alors V1= (C2 x V2) / C1= (500 x 100)/5 000= 10 ml. Pour avoir la solution n°2 (S2), Mettre 10ml de S1 dans une fiole de 100ml contenant environ 30ml d’eau déminéralisée, la homogénéiser et ramener le volume à 100ml. (Il ne faut pas oublier d’enlever les bulles)
Le tableau suivant résume les différents calculs pour avoir les V2 de six flacons :
V21(V2 du flacon n°1)= (V3 x C3) / C2 = (100 x 2,5) / 500 = 0,5 ml Or V22= 2 x V21, V23= 2 x V22, V24= 5 x V22, V25= 2 x V24 et V26= 2 x V25.
Tableau n°6 : Calcul du volume de solution n°2 (pour silicate) N° du
flacon
V2 (volume de la solution n°2) en ml
V3 (volume de la solution n°3) en ml
C3 (concentration de la solution n°3) en µmol/l
1 0,5 100 2,5
2 1 100 5
3 2 100 10
4 5 100 25
5 10 100 50
6 20 100 100
Pour avoir les solutions n°3 (S3), prendre 6 fioles de 100 ml, mettre les V2 (0,5ml / 1ml / 2ml / 5ml / 10ml et 20ml) dans les fioles, les compléter jusqu’à 100 ml et les homogénéiser.
Dosage
Prendre six flacons en plastique et deux autres pour les blancs, les rincer trois fois avec l’eau à analyser et les numéroter. Prélever 50ml de S3 dans les six flacons, pour les blancs mettre 50ml d’eau déminéralisée.
Ajouter 2ml de réactif 1 dans les huit flacons et mélanger rapidement ; Attendre au moins 7mn mais pas plus de 13mn ;
Ajouter 2ml de réactif 2 et mélanger ;
Sans attendre, ajouter 1ml de réactif 3 et mélanger.
Placer les flacons à l’abri de la lumière et laisser la réaction se poursuive pendant 2 à 3 heures.
Mesurer l’absorbance à l’aide d’un spectromètre à la longueur d’onde de 810nm en utilisant une cuve de 1cm.
Remarque : Les mesures d’absorbance sur les échantillons doivent subir les corrections de blanc de turbidité et de blanc des réactifs. Le blanc de turbidité est l’absorbance engendrée par les particules. Ce blanc devrait être négligeable. Le blanc de réactif est l’absorbance produite par les réactifs eux-mêmes (coloration propre ou présence de silicate). Il est impératif de le mesurer avec chaque série d’échantillons. Faire deux déterminations et prendre la moyenne.
Préparation des échantillons
Pour permettre la dépolymérisation du silicate, il faut toujours attendre que les échantillons soient revenus à la température ambiante après les avoir sorti du réfrigérateur. Notamment bien homogénéiser l’échantillon avant l’analyse et appliquer la procédure générale du dosage.
Courbe d’étalonnage
Après avoir fait le dosage de la solution étalon, tracer la droite d’étalonnage : Absorbance = f(concentration) et établir l’équation A = a.C + b.
4.10.3.6. Mesure de la concentration en phosphate
Le terme « phosphate » est employé ici pour designer l’ensemble des formes dissoutes, libres et complexées de l’ion orthophosphate PO43-. Le phosphore est un élément nutritif dont la forme minérale majoritaire, orthophosphate est essentielle à la vie aquatique. La méthode de Murphy J. et Riley J.P., 1962 reste encore aujourd’hui une des plus rapides et des plus simples pour le dosage des ions orthophosphate en eau de mer.
a- Matériel :
Le spectrophotomètre ou le colorimètre doivent avoir une gamme de longueurs d’ondes allant dans le proche infrarouge, le maximum d’absorption étant à 880 nm.
La réaction doit être faite dans des récipients en verre (flacons par exemple) réservés à ce dosage.
Pour de grandes séries, il est intéressant de prévoir des distributeurs répétitifs manuels en plastique pour les réactifs (par exemple : Multipette Eppendorf).
b- Réactifs :
On doit utiliser des produits de pureté « pour analyse » et de l’eau déminéralisée de haute qualité, fraîchement soutirée.
Il y a deux types de réactif :
Réactif 1 : solution d’acide ascorbique. Préparer la solution directement dans le flacon de stockage en verre marqué à 100ml.
Dans 100ml d’acide sulfurique à 2,9M, dissoudre 5g d’acide ascorbique. Conservée au réfrigérateur, cette solution est stable quelques semaines. La renouveler si elle brunit.
Pour préparer 1litre d’acide sulfurique à 2,9M, ajouter lentement en agitant constamment 160ml d’acide sulfurique concentré dans environ 800ml d’eau déminéralisée. Compléter au volume après refroidissement.
Réactif 2 : solution acide de molybdène et d’antimoine. Préparer la solution directement dans le flacon de stockage en verre. Dans
450ml d’acide sulfurique 2,9 mol/l, dissoudre 13g de molybdate d’ammonium. Dissoudre 0,30g d’oxytartrate d’antimoine dans 50ml d’eau déminéralisée, l’ajouter à la solution de molybdate et mélanger. Conservée à température ambiante, cette solution est stable plusieurs mois.
c- Mode opératoire :
Préparation des étalons
Un étalonnage de six niveaux de concentration (0,125µmol / 0,25µmol / 0,5µmol / 1µmol / 1,5µmol et 2µmol) a été fait pour vérifier la linéarité de la réponse dans la gamme de travail.
La solution étalon concentrée de phosphate à 5 000 µmol/l (solution n°1 ou solution mère : S1) a été obtenue en mélangeant 0,6805g de dihydrogénophosphate de potassium dans 1 000ml d’eau déminéralisée. Transférer la solution dans un flacon en verre ou en plastique. Cette solution se conserve plus d’un an à température ambiante et à l’abri de la lumière, sous réserve d’éviter l’évaporation (Aminot A. et Kérouel R., 1996).
Préparer la solution n°2 (S2) à partir de S1. On connaît : C2= 500 µmol/l (concentration de la solution n°2),
V2= 100 ml (volume de la solution n°2 à préparer) et C1= 5 000 µmol/l. Il reste à déterminer V1?
C1 x V1 = C2 x V2, alors V1= (C2 x V2) / C1= (50 x 100) / 5 000= 1ml.
Pour avoir la solution n°2 (S2), mettre 10ml de S1 dans une fiole de 100ml contenant environ 30ml d’eau déminéralisée, la homogénéiser et ramener le volume à 100ml. (Il ne faut pas oublier d’enlever les bulles)
Le tableau suivant résume les différents calculs pour avoir les V2 de six flacons :
V21(V2 du flacon n°1)= (V3 x C3) / C2 = (100 x 0,125)/50= 0,25ml Or V22= 0,5 x V21, V23= 2 x V22, V24= 2 x V23, V25= 3 x V23 et V26= 2 x V24.
Tableau n°7 : Calcul du volume de solution n°2 (pour phosphate) N° du
flacon
V2 (volume de la solution n°2) en ml
V3 (volume de la solution n°3) en ml
C3 (concentration de la solution n°3) en µmol/l
1 0,25 100 0,125
2 0,5 100 0,25
3 1 100 0,5
4 2 100 1
5 3 100 1,5
6 4 100 2
Pour avoir les solutions n°3 (S3), prendre 6 fioles de 100 ml, mettre les V2 (0,25ml / 0,5ml / 1ml / 2ml/ 3ml et 4ml) dans les fioles, les compléter jusqu’à 100 ml et les homogénéiser.
Dosage
Prendre six flacons en verre et deux autres pour les blancs, les rincer trois fois avec l’eau à analyser et les numéroter. Prélever 50ml de S3 dans les six flacons, pour les blancs mettre 50ml d’eau déminéralisée.
Ajouter 2ml de réactif 1 dans les huit flacons et mélanger ; Sans attendre, ajouter 2ml de réactif 2 et mélanger.
Laisser réagir pendant 5mn.
Mesurer l’absorbance à l’aide d’un spectromètre à la longueur d’onde de 880nm en utilisant une cuve de 10cm pour accroître la sensibilité.
Remarque : Les mesures d’absorbance sur les échantillons doivent subir les corrections de blanc de turbidité et de blanc des réactifs. Le blanc de turbidité est l’absorbance engendrée par les particules. Ce blanc devrait être négligeable. Le blanc de réactif est l’absorbance produite par les réactifs eux-mêmes (coloration propre ou présence de phosphate). Il est impératif de le mesurer avec chaque série d’échantillons. Faire deux déterminations et prendre la moyenne.
Préparation des échantillons
Comme les échantillons ont été congelés, il faut décongeler les flacons débout, en les agitant régulièrement pour les maintenir frais.
La décongélation peut être accélérée par au four à micro-ondes à très faible puissance (maintenir les échantillons frais). Il est déconseillé de décongeler à l’eau de robinet car celle-ci, très riche en nutriments, pourrait s’infiltrer dans le filetage du bouchon et contaminer l’échantillon à l’ouverture.
Notamment bien homogénéiser l’échantillon avant l’analyse et appliquer la procédure générale du dosage.
Courbe d’étalonnage
Après avoir fait le dosage de la solution étalon, tracer la droite d’étalonnage : Absorbance = f(concentration) et établir l’équation A = a.C + b.
4.10.3.7. Mesure de la concentration en ammonium
L’azote ammoniacal est présent sous deux formes en solution, l’ammoniac NH3
et l’ammonium NH4+ dont les proportions relatives dépendent du pH, de la température et de la salinité. Dans les eaux marines et estuariennes, l’ammonium est très prédominant. L’azote ammoniacal provient des excrétions animales et de la décomposition bactérienne des composés organiques azotés.
Il est utilisé par le phytoplancton comme source d’azote et oxydés par les bactéries nutrifiantes.
La méthode décrite par Koroleff F., 1969 a été adoptée pour l’analyse. C’est une méthode simple qui offre une bonne précision ainsi qu’une bonne sensibilité.
a- Matériel :
Le spectrophotomètre ou le colorimètre doivent avoir une gamme de longueurs d’ondes de 630nm.
Des fioles de 250ml sont nécessaire pour préparer les solutions étalons.
La réaction doit être faite dans des récipients en verre strictement réservés à ce dosage.
Pour ajouter les réactifs, il est nécessaire de prévoir des distributeurs répétitifs sur flacons.
b- Réactifs :
On doit utiliser des produits de pureté « pour analyse » et de l’eau déminéralisée de haute qualité, fraîchement soutirée.
Les deux réactifs de travail sont peu stables et très sensible à la lumière. Les conserver en flacons bruns et ne pas les exposer à la lumière lorsqu’ils sont sortis du réfrigérateur pour l’utilisation.
Réactif 1 : solution de phénol-nitroprussiate. Dissoudre 13g de phénol dans 50ml d’eau minéralisée. Ajouter et dissoudre 0,3g de nitroprussite de sodium dihydraté, puis compléter à 200ml. Conservée au réfrigérateur, cette solution est stable 2 à 3 semaines. La renouveler si elle prend une teinte verdâtre.