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Les interactions effectives entre résidus hydrophobes

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23 Méthodes d’identification des différents facteurs

3.5 Propension relative d’exposition au solvant d’un résidu

4.1.2 Les interactions effectives entre résidus hydrophobes

Afin d’étudier la dépendance en la température des interactions protéiques, nous avons dérivé le potentiel de distance AW^s (eq 3.6) entre les paires de résidus susceptibles de former une des quatre interactions considérées. Comme pour les contributions à un corps, nous avons dérivé ce potentiel à partir des cinq groupes de résistance thermique moyenne croissante de la série de groupes (section 3.1.2.1). Les différences entre les profils énergétiques dérivés de ces cinq environnements protéiques de résistance thermique moyenne distincte sont les témoins de l’influence de la température sur une interaction donnée. Il est à noter que l’estimation de l’énergie libre d’une interaction à l’aide de potentiels statistiques est une estimation moyennée sur toutes les autres interactions et qu’il s’agit donc d’une estimation relative. Nous avons en outre calculé les fonctions de distributions des distances inter-résidus entre centres géométriques (Cji) des partenaires formant ces interactions protéiques. Ces fonctions de distribution vont nous permettre d’évaluer les distances inter-résidus les plus représentatives entre les partenaires formant une interaction.

L’effet hydrophobe constitue l’un des principaux facteurs responsables du repliement spontané des protéines en leur structure native Le terme hydrophobe provient du grec {hydro = eau ctfôbos = peur) et désigne le caractère répulsif envers l’eau. Il s’agit de la tendance qu’ont deux composés apolaires à s’attirer mutuellement en milieu aqueux. Ainsi, un système constitué d’une émulsion de fines gouttelettes d’huile dans un solvant polaire comme l’eau évolue spontanément vers un état où les deux liquides sont séparés de manière à minimiser leur surface de contact.

Chapitre 4 — Dépendance en la température d’interactions protéiques

o°o o°o

oQo + oQo

0^0 0^0 O O O O OOO O

goosO

q

O oO

o=

corps hydrophobe O = molécule d'eau

Figure 4.6 - Représentation schématique de l’effet hydrophobe.

La solvatation d’un corps hydrophobe dans un milieu aqueux est défavorable car les molécules d’eau sont contraintes de former une « cage » autour de ce soluté. L’immobilisation des molécules d’eau autour de ce corps hydrophobe entraine une perte d’entropie du système. Afin de minimiser les pertes d’entropie liées à ce phénomène les corps hydrophobes se rassemblent entre eux, minimisant ainsi le nombre de molécules d’eau immobilisées. A l’état dénaturé, une protéine peut être considérée comme une chaîne polypeptidique sans structure évoluant dans un milieu aqueux. Dans cet état, la présence d’acides aminés hydrophobes le long de la chaîne polypeptidique entraine une large surface de contact entre le milieu aqueux et ces corps hydrophobes. De la même manière que l’émulsion de gouttelettes d’huile, la solvatation de ces résidus hydrophobe entraine une perte d’entropie liée à l’immobilisation des molécules d’eau. Ce phénomène déstabilise fortement l’état dénaturé d’une protéine au profit de son repliement en une structure tridimensionnelle compacte.

Les interactions effectives entre résidus hydrophobes considérées ici sont celles établies entre les résidus aliphatiques I, L et V. Ces résidus ne peuvent interagir avec d’autres acides aminés qu’au travers de l’effet hydrophobe. De cette manière, nous nous assurons d’éviter de mélanger les contributions énergétiques liées uniquement à l’effet hydrophobe entre deux résidus avec les contributions d’interactions de nature différente. En effet, bien qu’il y ait clairement d’autres résidus hydrophobes, des spécificités de leur chaîne latérale leur permettent de former d’autres interactions {e.g. F).

JD *o A O

Figure 4.7 - Potentiel de distance des paires de résidus [PL] et [L-V]. Légende cf.

Il n’y a pas d’interaction à proprement parler entre deux résidus hydrophobes solvatés en milieu aqueux, il s’agit plutôt d’interactions effectives liées à l’effet hydrophobe poussant ces acides aminés à se mettre en contact. La contribution énergétique de ces interactions effectives entre deux acides aminés hydrophobes au sein des protéines est généralement favorable et résulte essentiellement des préférences individuelles de chacun De plus, la contribution de telles interactions effectives ne dépend pas de la température. En effet, les cinq fonctions énergétiques les décrivant dérivées à partir des cinq groupes de protéines de résistance thermique moyenne croissante présentent quasi le même comportement (fig.4.7).

La dépendance en la température de fusion de l’effet hydrophobe entre deux résidus illustrée par ces résultats indique que leur contribution favorable à la stabiüté thermodynamique ne dépend pas de la température relativement aux autres interactions protéiques. Ainsi, ce type d’interactions est aussi stabilisant au sein de protéines thermostables que mésostables.

Ce résultat intéressant, mettant en exergue l’indépendance de la contribution relative de ces interactions avec la température de fusion des protéines, nous a poussés à en vérifier sa significativité. Pour y parvenir, nous avons d’une part adapté ce potentiel de distance aux caractéristiques particulières de composition et de compacité des protéines thermostables souvent mises en avant dans la littérature ( , section 3.2, eq. 3.12) D’autre part nous avons conçu une nouvelle série de 4 groupes de protéines de résistance thermique moyenne différente présentant un recouvrement moins important (section 3.1.2.3). Cette nouvelle division permet de mieux distinguer les profils énergétiques qui en sont dérivés. A l’image de cette division, nous avons généré 1000 séries aléatoires de quatre groupes permettant d’attester la significativité de nos résultats (section 3.1.3). Ainsi, nous avons évalué leur significativité statistique en calculant la probabilité d’observer, parmi ces séries de groupes aléatoires, des écarts entre profils énergétiques aussi importants que ceux dérivés de

la série .

Figure 4.8 - Potentiel de distance des paires de résidus [I-L] et [I-I]. Ces fonctions d’énergie sont dérivées en fonction de la distance inter-résidus d entre centres géométriques (C^-C^). Les couleurs des quatre fonctions d’énergie dérivées à partir des quatre groupes de protéines de la série

Q(4)BDt correspondent à celles définies au tableau 3.5 (à savoir : classés en

fonction de leur résistance thermique moyenne croissante). Figure réalisée avec le logiciel XMgrace

Chapitre 4 — Dépendance en la température d’interactions protéiques

En dérivant notre nouveau potentiel de distance à partir de ces quatre groupes de protéines de résistance moyenne croissante, nous observons à nouveau la contribution généralement favorable au repliement des protéines de l’effet hydrophobe entre deux acides aminés aliphatiques (fig. 4.8). En effet, ces contributions énergétiques présentent un large minimum à des distances inter-résidus proches de 5,75 À lorsque les acides aminés hydrophobes considérés sont ceux ayant la chaîne latérale la plus longue (I et L) et aux alentours de 5 Â lorsque la valine est l’un des partenaires. Les valeurs aux minima de ces contributions énergétiques sont plus négatives lorsque les résidus hydrophobes considérés sont ceux ayant la chaîne latérale la plus longue (aux alentours de -0,9 kcal/mole), donc plus hydrophobes. Elles sont légèrement moins favorables à la stabilité thermodynamique des protéines lorsqu’elles incluent la valine comme partenaire avec des valeurs d’environ -0,8 kcal/mole.

De même qu’avec le potentiel de distance AW^j, nous pouvons constater que les contributions énergétiques obtenues avec notre nouveau potentiel sont quasi indépendantes de la température (fig. 4.8 graphique de gauche). Non seulement les comportements des 4 fonctions d’énergie dérivées sont très proches mais en plus la probabilité d’observer de tels écarts entre les groupes de séries aléatoires est grande. Ces écarts ont été mesurés et analysés à l’aide des critères d’écarts énergétiques entre les minima d’énergie (De, section 3.4.1) et le critère de progression entre les profils énergétiques (Dp, section 3.4.2). Le premier critère De mesure les écarts énergétiques AAW= , à la distance

‘ m

inter-résidus Cp-Cp correspondant à un minimum d’énergie, entre les profils énergétiques dérivées des deux groupes de résistance thermique moyenne les plus extrêmes et

qWbd^ probabilité d’observer ces écarts parmi les séries aléatoires est notée Pg. Le deuxième critère Dp évalue l’adéquation entre la progression de la valeur d’énergie fibre en ces minima avec la progression de température de fusion moyenne des différents groupes. La probabilité d’observer ce critère parmi les séries aléatoires est notée Pp.

La probabilité Pg de trouver de tels écarts Dg est généralement assez grande parmi les séries aléatoires de 4 groupes de protéines (tableau 4.2). En outre, même lorsque certains écarts sont observés, il n’y a pas de progression Dp entre les groupes allant de celui ayant la résistance thermique moyenne la plus faible à celui possédant celle la plus élevée (fig. 4.8 graphique de gauche).

Parmi toutes les interactions effectives entre résidus hydrophobes que nous avons considérées il y a cependant une exception. En effet, en plus d’une progression entre les contributions énergétiques dérivées des quatre groupes de protéines de résistance thermique moyenne croissante, l’interaction effective entre deux isoleucines montre une différence énergétique AAVV'jr entre et de 0,17 kcal/mole (fig. 4.10 graphique de droite). La probabilité Pg de retrouver un tel écart entre les profils énergétiques au sein des 1000 séries aléatoires est de 0,089 (tableau 4.2). De plus, la probabilité conjointe d’observer aléatoirement un tel écart Pg conjointement avec une telle progression Pp entre les groupes est de 0,071 seulement.

Paire de résidus

De''

(kcal/mole)

< De >AL (o) *

(kcal/mole) Pe" Pe&Pp" [I-I] 0,17 0,00 (0,10) 0,089 0,071 [I-L] 0,03 0,00 (0,08) 0,677 / [I-V] 0,08 0,01 (0,09) 0,388 / [L-Ll 0,03 0,00 (0,10) 0,788 / [L-V] 0,04 0,00 (0,10) 0,723 / fv-vi 0,04 0,02 (0,10) 0,696 /

Tableau 4.2 - Ecarts entre les profils énergétiques dérivés des groupes pour les interactions entre paires de résidus hydrophobes. De est l’écart énergétique calculé entre les minima des profils énergétiques dérivés des groupes et (section 3.1.2.3), * < De >AL est la moyenne des écarts De observés parmi les séries de groupes aléatoires, Pe est la probabilité d’observer, parmi les séries de quatre groupes aléatoires, un écart énergétique aussi grand (en valeur absolue) que celui observé entre les courbes issues des groupes et .

Pc & Pp est la probabilité conjointe d’observer un écart énergétique De et une progression monotone Dp entre les minima des quatre profils énergétiques (section 3.4.2, fig. 3.9), « / » signifie qu’aucune progression n’est observée entre les profils énergétiques dérivés des groupes de résistance thermique moyenne distincte .

Le comportement particulier de cette interaction entre deux isoleucines semble provenir uniquement de la variation de l’abondance de cet acide aminé au sein des groupes de résistance thermique moyenne distincte. En effet, le taux d’isoleucine dans un groupe est plus élevé plus sa est élevée (de 4,9% à 5,3%, tableau 3.6). Puisque notre potentiel tient compte de la variation de composition entre les différents groupes il n’est pas étonnant que les profils énergétiques qui en découlent soient fortement influencés. Cette interprétation est en outre corroborée par le fait que ces écarts énergétiques ne sont pas observés lors de la dérivation du potentiel déWds ne tenant pas compte de la variation de composition entre les groupes. La plus forte abondance de cet acide aminé au sein des protéines thermostables peut s’expliquer de deux manières différentes.

Premièrement, il se pourrait que cette variation de composition en isoleucine parmi nos quatre groupes de protéines de résistance thermique moyenne croissante soit un artefact lié à notre base de données de protéines monomériques relativement restreinte. Pour appuyer cette hypothèse, nous avons examiné la probabilité conjointe Pe & Pp que parmi les six interactions effectives entre I, L et V, l’une d’elles présente un écart aussi important avec une telle progression. En effet, il est difficile de trouver des dissemblances physiques entre l’interaction effective de deux isoleucines et celles des autres paires d’acides aminés hydrophobes aliphatiques capables d’expliquer cette différence. Dès lors, en considérant que ces interactions effectives ont des caractéristiques physiques identiques, nous pouvons calculer la probabilité d’observer qu’une de ces six interactions effectives présente un écart aussi important avec une telle progression entre les contributions énergétiques dérivées les mille séries aléatoires. Cette probabilité est estimée à 0,28 parmi les mille séries aléatoires. Cette valeur suggère que la dépendance en la température de l’interaction effective entre deux isoleucines pourrait n’être qu’une simple fluctuation statistique.

Deuxièmement, l’isoleucine a un caractère hydrophobe plus prononcé que L et V

L’interaction effective entre deux isoleucines est donc énergétiquement plus grande et plus favorable à la stabilité des protéines. Les protéines thermostables seraient donc plus susceptibles de présenter ces interactions afin d’augmenter leur thermostabilité en augmentant

Chapitre 4 - Dépendance en la température d’interactions protéiques

leur stabilité thermodynamique, autrement dit : en abaissant l’entièreté de leur courbe de stabilité (fig. 1.11, adaptation a—Ce deuxième point est plus longuement discuté à la section 4.2.1.6.

La dérivation de ce nouveau potentiel de distance tenant compte de l’adaptation de la composition et de la compacité des protéines thermostables à partir de groupes de protéines de résistance thermique moyennes croissantes corrobore nos précédents résultats. A l’aide de notre méthode d’analyse et de la génération de séries aléatoires nous avons également pu apporter un indice de confiance à nos observations. Finalement, il s’avère que par rapport aux autres interactions protéiques décrites par ces potentiels de distance, la contribution énergétique à la stabilité des protéines des interactions effectives entre deux acides aminés hydrophobes aliphatiques ne dépend pas de la température, exception faite de la paire [I-I]. Le développement d’une plus grande base de données de protéines monomériques de température de fusion et de structure connues serait nécessaire pour confirmer ou infirmer la dépendance particulière de cette paire de résidus.

4.1.3 T.,es ponts salin.s

Les ponts salins sont des interactions électrostatiques entre deux acides aminés portant des charges de signe opposé. Dans une protéine ces interactions se forment entre les acides aminés chargés négativement (D, E) et ceux chargés positivement (K, R). Dans ce travail nous ne considérons pas l’histidine parmi les acides aminés chargés car celle-ci peut être chargée ou non en fonction de petites variations de son environnement proche même dans des conditions physiologiques. Par ailleurs le caractère aromatique de sa chaîne latérale lui permet de former également des interactions de type 7t-7i (e.g. interactions cation-7i et aromatiques).

Déjà en 1975 à partir de comparaisons sur des protéines issues d’organismes mésophiles et thermophiles ces interactions ont été suggérées comme influençant favorablement la thermostabilité des protéines Quelques années plus tard, cette interaction a fait l’objet d’une étude théorique montrant leur influence déstabilisante au sein des protéines De façon générale les ponts salins ont un effet déstabilisant (ou très faiblement stabilisant) à température ambiante sur la structure native d’une protéine. Ceci est lié à la grande pénalité de désolvatation encourue en amenant à se rencontrer les chaînes latérales chargées de la protéine non repliée en contact avec le solvant pour former un pont salin dans la structure repliée de la protéine. En effet, bien que l’interaction coulombienne entre les deux résidus formant le pont salin soit clairement stabilisante, elle n’est généralement pas suffisante pour contrecarrer le changement défavorable de solvatation. Ce type d’interaction est cependant présent en plus grande quantité au sein d’homologues thermostables de plusieurs familles de protéines. Ce n’est que plus tard qu’une réconciliation aura lieu grâce à une étude théorique montrant que la pénalité de désolvatation encourue lors de la formation d’un pont salin est réduite à des températures élevées

Ainsi, au sein de protéines issues d’organismes thermophiles, la contribution des ponts salins à leur énergie libre de repliement est plus importante. Celle-ci serait atteinte en évitant les répulsions électrostatiques tout en optimisant les distances entre la paire de résidus en interaction et entre les ponts salins eux-mêmes formant ainsi des réseaux électrostatiques. Une étude menée sur 222 ponts salins au sein de 36 protéines monomériques à l’aide d’un continuum électrostatique montre que 86% de ces ponts salins ont une contribution favorable à l’énergie libre de repliement des protéines De plus, ceux présentant la plus forte contribution sont ceux situés en plein cœur des protéines. Il semblerait que la grande pénalité

de désolvatation encourue lors de l’enfouissement d’une paire de résidus chargés au cœur d’une protéine soit contrebalancée par l’augmentation de leur force d’interaction grâce au plus faible effet d’écrantage dû au solvant. En effet, la constante diélectrique présente au cœur d’une protéine est beaucoup plus faible que celle de l’eau conduisant à des interactions électrostatiques de plus grande valeur énergétique. D’autre part cette étude montre que l’effet stabibsant de cette interaction dépend fortement de la conformation entre les atomes chargés des deux résidus en interaction (fig. 4.9) :

O

a) aucun des deux atomes d’oxygène du résidu chargé négativement n’est à moins de 4A de l’atome portant la charge positive de l’autre résidu.

b) un seul des atomes d’oxygène du résidu chargé négativement est à moins de 4À de l’atome portant la charge positive de l’autre résidu.

c) les deux atomes d’oxygène du résidu chargé négativement sont à moins de 4À de l’atome portant la charge positive de l’autre résidu.

Figure 4.9 - Conformations possibles entre E et K formant un pont salin. Ces conformations sont classées en fonction de leur contribution énergétique croissante (a—>c). Figure adaptée de la référence

Ces différentes conformations d’un même type de pont salin nous ont poussés à étudier de plus près leur géométrie. Nous avons premièrement identifié tous les ponts salins rencontrés dans une grande base de données structurale de 540 protéines monomériques (section 3.1.4). Ensuite nous les avons classés en fonction du type d’acides aminés impliqués et de leur géométrie à l’aide d’un algorithme de classification se basant sur la déviation de l’écart quadratique moyen (rmsd) entre les coordonnées spatiales des atomes de leurs chaînes latérales après superposition (section 3.3). Par ailleurs, les potentiels statistiques que nous dérivons se basent sur des distances inter-résidus et non interatomiques. Dès lors, nous avons évalué les distances entre centres géométriques de résidus (C^) les plus représentatives de chacune des classes de chaque type de pont salin. Plus précisément, nous avons calculé pour chacun des quatre types de ponts s^ins [D-K], [E-K], [D-R] et [E-R] la fonction de distribution des distances inter-résidus C^-C^ au sein de chacune des classes formées. Lors de l’analyse des profils énergétiques, ces fonctions de distribution nous ont permis de mieux appréhender les intervalles de distance auxquels ces résidus forment préférentiellement des ponts salins.

Paire de Nombre rmsd “ <d>’’ o" résidus d’occurrences (Â) (Â) (Â) [D-K] 730 0.38 4.52 0.78 [E-K] 758 0.40 4.78 0.87

Tableau 4.3 — Classification des ponts salins formés avec la lysine selon leurs géométries d’interaction. ° Il s’agit de l’écart quadratique moyen des coordonnées spatiales des atomes de tous les ponts salins d’une même classe après superposition (section 3.3). ’’ Correspond à la distance moyenne inter-résidus C^-Cj, de la paire de résidus formant un pont salin dans la classe considérée, dont l’écart type est donné en

Chapitre 4 - Dépendance en la température d’interactions protéiques

En suivant cette procédure de classification des différentes géométries d’interaction des quatre types de ponts salins considérés, ceux formés avec la lysine [D-K] et [E-K] ont tous été répartis en une seule classe. En effet, les conformations adoptées par ces deux paires de résidus [D-K] et [E-K] formant 730 et 758 ponts salins respectivement au sein de 540 protéines monomériques, sont tellement proches que notre algorithme ne distingue qu’une seule classe pour chacun d’eux. En effet, la superposition des 730 (758) ponts salins formés avec la paire de résidus [D-K] ([E-K]) ne présente qu’un écart type moyen de 0,38 (0,40) (tableau 4.3).

A l’inverse, notre algorithme de classification répartit les deux types de ponts salins formés avec l’arginine [D-R] et [E-R] en deux classes distinctes chacun (tableau 4.4). Ainsi, nous avons constaté que les ponts salins formés entre la pîdre de résidus [D-R] et [E-R] adoptent soit une conformation où les centres géométriques des deux résidus sont forts proches soit une conformation où la distance inter-résidus entre leurs est plus grande (tableau 4.4). En effet, sur les 1.288 (1.244) ponts salins formés entre la paire de résidus [D-R] ([E-R]), 780 (728) adoptent une conformation où les centres géométriques des deux résidus sont fort proches d’environ ~4,3Â (~4,6Â) et 508 (516) où la distance inter-résidus

O O

entre leurs est plus grande d’environ ~5,5A (~5,7A). En examinant les géométnes d’interaction des ponts salins les plus représentatifs de chacune des deux classes de [D-R] et [E-R], nous avons identifié deux géométries d’interaction bien distinctes La première, que nous avons baptisé « fork-stick », est adoptée lorsque les deux atomes d’oxygène du

O

résidu chargé négativement (D ou E) sont respectivement à moins de 4,0 A de l’atome et d’un des deux atomes ou N;^2 de l’arginine (fig. 4.10, schéma a). La deuxième est adoptée lorsque les chaînes latérales des deux résidus formant le pont salin sont alignées et leurs extrémités chargées se font face. Seuls les deux atomes N;;/ ou N;^2 de l’arginine sont chacun

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