Les enzymes employées dans le compartiment cathodique

Au cours de ce travail, on s’est intéressé au compartiment cathodique de la biopile enzymatique. Les enzymes les plus largement utilisées appartiennent à la famille des oxydases multi-cuivres (MCOs). Elles constituent une famille d’enzymes capables d’oxyder divers substrats concomitamment avec la réduction de l’oxygène en eau. Elles peuvent être divisées en deux catégories. On distingue les MCOs capables d’oxyder des substrats organiques (oxydases organiques) tels que les phénols. Dans cette catégorie, on retrouve les laccases, les bilirubines oxydases et l’ascorbate oxydase. Le deuxième type de MCOs est capable d’oxyder des ions métalliques (métalloxydases) [18]. Les métalloxydases sont spécifiques vis-à-vis de leur substrat tandis que les oxydases organiques présentent une large variété de substrats. Le bilan de la réaction enzymatique est le suivant :

4 H⁺ + 4 substrats + O2  2 H2O + 4 produits

Les MCOs contiennent quatre atomes de cuivre pouvant être classés en trois catégories selon leurs caractéristiques spectroscopiques. On distingue le cuivre T1 caractérisé par une absorption intense à l’origine de la coloration bleue dans le domaine du visible (600 nm) en raison de la liaison covalente entre le cuivre et le ligand histidine. Il possède aussi un signal en résonance magnétique nucléaire (RMN). Ce cuivre constitue le site d’entrée des électrons à partir de divers substrats (il s’agit du site où se déroule la réaction d’oxydation du substrat). Le cuivre T2 ne présente aucune bande d’absorption mais présente des propriétés paramagnétiques.

Le centre cuivrique bi-nucléaire T3 présente quant à lui une absorption intense à 330 nm dûe au pont hydroxyde reliant les deux atomes de cuivre. Les sites de cuivre T2 et bi-nucléaire T3 forment ce que l’on appelle un cluster trinucléaire. La réaction de réduction de l’oxygène en eau s’effectue au niveau de ce cluster (Figure I.10) [19].

Figure I.10: Réactions catalysées par les MCOs

22 Sur la base des études cristallographiques, l’environnement des cuivres a été déterminé. Le cuivre T1 est coordonné au minimum par deux ligands histidines et un ligand cystéine. Dans de nombreux MCOs, un quatrième ligand en position axiale (la méthionine) peut être coordonné à l’atome de cuivre. La coordinence du cuivre est égale à quatre. Cette structure a été retrouvée chez certaines variétés de laccases issues des végétaux. Lorsque le cuivre est seulement coordonné à 3 ligands, il possède une géométrie trigonale plane. Un résidu hydrophobe (phénylalanine ou leucine) non coordonné est situé en position axial. On retrouve cette structure dans les laccases issues de champignons. Le cluster tri-nucléaire est situé à une distance de 13 Å environ du cuivre T1. Le cuivre T1 est connecté au cluster par un tri-peptide histidine-cystéine-histidine. Le cuivre T2 du cluster est coordonné à deux ligands histidines et un ligand aqueux (H2O) situé en dehors du cluster. Les deux cuivres formant le centre bi-nucléaire sont coordonnés chacun à trois ligands histidines. A l’état oxydé, ils sont reliés par un pont hydroxyde [20].

Figure I.11: Mécanisme de réduction du dioxygène [21]

23 Le mécanisme catalytique de réduction du dioxygène par les MCOs a été largement étudié dans la littérature (Figure I.11). Il est constitué de deux étapes de réduction à deux électrons. Il implique un transfert intramoléculaire rapide de quatre électrons du cuivre T1 au cluster tri-nucléaire. Tout d’abord, la forme réduite de l’enzyme va réagir avec le dioxygène avec une constante de vitesse de 1,7×10⁶ M^-1 s^-1 pour former un intermédiaire peroxyde. Au sein de cet intermédiaire, le dioxygène gagne deux électrons et est coordiné avec les trois atomes de cuivre formant le cluster tri-nucléaire. Le cuivre T2 et l’un des cuivres du centre bi-nucléaire sont à l’état oxydé. La liaison O-O de cet intermédiaire suite à un transfert d’un électron et d’un proton du cuivre T1 va se cliver afin de former l’intermédiaire natif dans lequel l’ensemble des cuivres sont à l’état oxydé. Les atomes d’oxygène totalement réduits restent liés en tant que ligand (pontant) au cluster tri-nucléaire. Cette étape de clivage est cinétiquement déterminante. La constante de vitesse est supérieure à 350 s^-1. La réduction rapide à quatre électrons des centres cuivriques de l’intermédiaire natif conduit par la suite à la libération de deux molécules d’eau et à la régénération de l’enzyme (enzyme réduite). En l’absence de substrat réducteur, l’intermédiaire natif se transforme lentement en une enzyme oxydée où les trois atomes de cuivre constituant le cluster sont à l’état oxydé. Une molécule d’eau située à l’intérieur du cluster est libérée tandis que les autres forment un pont hydroxyde entre les centres cuivriques T3. Bien que le mécanisme de réduction du dioxygène soit très bien décrit dans la littérature, l’étape dans laquelle le substrat est oxydé et le cluster tri-nucléaire est réduit est moins connue.

Dans cette étape, quatre électrons successifs réduisent le Cu(I) au site T1 en concomitance avec le transfert intramoléculaire des électrons entre le cuivre du site T1 et le cluster T2/T3 [19-21].

Il faut savoir que le substrat réducteur peut être remplacé par une électrode. Pour cette raison, en plus du fait que les MCOs sont capables de réduire l’oxygène, les MCOs ont été utilisées en tant que catalyseur cathodique dans les biopiles enzymatiques. La laccase et la bilirubine oxydase sont généralement utilisées dans ce dispositif (pour la réduction du dioxygène). Dans une moindre mesure, la cytochrome oxydase et le cytochrome c, deux enzymes dont le site actif est composé d’un centre hémique, ont également été utilisées [22].

Dans le cas de la réduction de H2O2, la micropéroxydase [23, 24] et la peroxydase de raifort [25] sont couramment utilisées. Le Tableau I.2 regroupe les principales enzymes utilisées dans le compartiment cathodique des biopiles. On va s’intéresser ci-après à la laccase B de Trametes versicolor.

24 Tableau I.2: Enzymes utilisées dans le compartiment cathodique d’une biopile [22]

Oxydant Enzyme Métal/Cofacteur Demi-réaction

Oxygène

La laccase a été découverte pour la première fois en 1883 par Yoshida chez une variété d’arbre, le Rhus vernifica. Depuis cette découverte, elle a été identifiée dans d'autres végétaux (mangue, pêche…), dans des bactéries (Azospirillum lipoferum), chez certains insectes (Bombyx calliphora) et surtout chez un grand nombre de champignons. Plus de soixante espèces de champignons producteurs de laccase ont été décrites à ce jour. Les plus importants sont essentiellement des basidiomycètes tels que le Trametes versicolor (T. versicolor), un champignon de la pourriture blanche (observée au cours de la dégradation du bois).