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LA VOIE D'EMBDEN-MEYERHOF ET LA DERIVATION DE RAPOPORT- LUEBERING

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3.3.1. Utilisation du glucose et formation de lactate

Le sang est prélevé par ponction jugulaire, hépariné et placé dans un bain de glace. La centrifugation est effectuée rapidement et le plasma est décanté ; après élimination de la couche leucocytaire, les globules rouges sont suspendus dans le plasma et l'hématocrite est déterminé. Une partie de la suspension est déféquée par addition d'un volume égal d'acide perchlorique froid à 6 % et immédiatement congelée; le reste de la suspension est incubé pendant 2 heures à 37° en anaérobiose avec agitation douce, puis soumis à une défécation identique.

Le taux de lactate est déterminé par la technique de Hohorst (1970) et celui de gluco­ se par la méthode à l'HK-G6PD (Bergmeyer et coll., 1970), qui s'est avérée plus précise que la méthode à la glucose-oxydase □

A ; Monitrol /, Dade.

O ; Appareil Radiometer B MS 3.

□ .• Toutes les mesures d'activités enzymatiques ainsi que les dosages des métabolites et des nucléotides

sont effectués en utilisant un spectrophotomètre Beckman DB-T raccordé à un enregistreur automa­ tique Kontron type 1100. Pour chaque enzyme étudiée, la température est maintenue constante en utilisant un dispositif de thermostatisation. Les substrats et enzymes sont généralement fournis par Boehringer-Mannheim.

3.3.2. Activités enzymatiques.

Le sang est recueilli sur héparine et placé dans un bain de glace, puis rapidement lavé 3 fois avec une solution de chlorure de sodium à 9g/1000 ml en éliminant la couche leucocytaire. Les érythrocytes lavés sont immédiatement congelés et envoyés à Bruxelles où les analyses sont effectuées dans les 5 jours qui suivent le prélèvement. Aucune différence significative n'est observée entre les activités enzymatiques déter­ minées immédiatement et celles évaluées sur les érythrocytes conservés de cette manière

(Mandelbaum et coll., 1973).

L'activité de la PK est mesurée selon la méthode de Tanaka et coll. (1962) et celle de l'HK selon la méthode de Valentine et coll. (1968).

3.3.3. Métabolites de la voie d'F.mbden-Meyerhof et 2,3-DPG.

Le sang est prélevé par ponction jugulaire et la défécation est effectuée sans aucun délai par addition d'un volume égal d'acide perchlorique froid à 6 %. Après centrifu­ gation, les surnageants sont neutralisés par addition d'une solution d'hydroxyde de po­ tassium et sont conservés à —25°C jusqu'au moment des analyses, qui sont effectuées selon les méthodes décrites par Minakami et coll. (1965) et par Rose et Liebowitz (1970).

En fonction des données de la littérature et de nos propres observations, les intermédiai­ res dosés sont stables dans les conditions de conservation précitées ; certains métabolites instables, dont les trioses-phosphates ou le pyruvate, ne peuvent par contre être étudiés valablement. La reproductibilité des mesures du G6P, du F6P, du FDP, du lactate et du 2,3-DPG a été déterminée en répétant au moins 10 fois les mesures de standards appro­ priés : les coefficients de variation vont de 2 à 3 % sauf pour le F6P (5,0 %).

3.3.4. Adénosine di- et triphosphate.

Les échantillons sont préparés de la même manière que pour l'étude des intermédiaires glycolytiques. L'ATP est dosé selon Brewer et Powell (1966) et l'ADP selon Jaworek et coll. (1970). La reproductibilité des mesures est du même ordre que pour les intermé­ diaires glycolytiques (coefficients de variation compris entre 2 et 3 %).

3.3.5. Effet de l'incubation anaérobie sur le taux de 2,3-DPG.

Le sang est recueilli sur héparine. Une partie du sang est immédiatement déféquée par addition d'acide perchlorique froid à 6 %; le reste est incubé à 37° pendant 2 heures sous flux constant d'azote humidifié dans des conditions telles que la pC02 est de 40 Torr

(Fondu et Mandelbaum, 1975), puis déféqué. Les surnageants sont congelés à —25° et

le taux de 2,3-DPG est déterminé ultérieurement par la méthode de Rose et LiebowitZv (1970).

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-La relative brièveté des incubations répond à deux impératifs : le taux de glucose ne s'abaisse pas à des valeurs non saturantes pour l'HK et il n'y a pas d'accumulation importante de lactate qui, en augmentant le rapport NADH/NAD, pourrait modifier sensiblement la constante d'équilibre de la GARD (Rose et Warms, 1970).

3.4. LA VOIE DES PENTOSES-PHOSPHATES ET LA REDUCTION DE L'OXYGENE

ACTIVE.

3.4.1. Corps de Heinz.

La technique utilisée est une variante de la méthode de Beutler et coll. (1955). Après incubation en présence d'une solution fraîche d'acétylphénylhydrazine et révélation des corps de Heinz par addition d'une solution de crystal violet selon les conditions défi­ nies par ces auteurs, la suspension de globules est centrifugée et des frottis sont réalisés avec le culot globulaire. Le pourcentage d'hématies contenant au moins 5 corps de Heinz est déterminé par comptage de 500 globules. Chaque lecture est faite par 2 ob­ servateurs et la moyenne est calculée.

3.4.2. Glutathion réduit.

Le sang est prélevé sur ACD "NIH" A et maintenu dans un bain de glace. Les dosages sont entrepris dans les 24 heures qui suivent, selon la méthode de Beutler et coll. (1963), choisie en raison de sa haute sensibilité et de son excellente reproductivité. Des études préliminaires ne nous ont révélé aucune dénaturation appréciable du GSH dans ces con­ ditions de conservation des échantillons sanguins.

3.4.3. Activités enzymatiques.

Les prélèvements sanguins servant à la mesure des activités de la G6PD et la 6PGD sont traités de la même manière que pour l'étude de l'HK et de la PK; toutefois, les globules lavés doivent être enrichis en NADP (2 mg/ml de culot globulaire) afin d'éviter une perte d'activité de la G6PD (Mandelbaum et coll., 1973). Les activités de la G6PD et de la 6PGD sont déterminées dans les 5 jours selon la méthode de Marks (1958), les 2 réactions étant couplées selon Bishop (1966).

Pour l'étude de la GSSG-réd, les échantillons de sang collecté sur héparine sont rapidement lavés 3 fois en utilisant une solution de chlorure de sodium à 9g/1000 ml. Les culots globulaires sont congelés et les déterminations enzymatiques, avec ou sans addition de FAD, sont effectuées selon la technique de Sauberlich et coll. (1972) dans les 8 jours qui

suivent le prélèvement.

Le sang servant à la détermination de l'activité de la GSH-Px est prélevé sur ACD"NIH"A et immédiatement placé dans un bain de glace jusqu'au moment de l'analyse. Celle-ci est

effectuée à Bruxelles dans les 24 heures qui suivent, selon la méthode de Paglia et Valentine (1967) modifiée par Mandelbaum (1976) afin de tenir compte d'une manière optimale de l'oxydation non enzymatique du GSH par l'H2 02 dans le milieu réactionnel.

L'activité de la SOD est déterminée par la méthode de Misra et Fridovich (1972) après extraction selon Concetti et coll. (1975), sur les mêmes échantillons que ceux utilisés pour l'étude de la GSH-Px. Les résultats sont exprimés par rapport à un standard de SOD d'origine bovine. Le coefficient de variation de 12 mesures du même standard, effectuées à divers intervalles pendant une période totale de 4 mois, est de 7%. Le coefficient de variation de 6 mesures réalisées le même jour est de 3%.

Des essais préalables nous permettent de conclure que les activités des enzymes étu­ diées ne sont pas altérées dans les conditions de conservation décrites.

3.4.4. Sélénium.

Le taux de sélénium est déterminé par la méthode sensible et reproductible mise au point par Nève et Hanocq (1977). Après minéralisation en présence d'acide nitrique, d'acide sulfurique, d'acide perchlorique et de peroxyde d'hydrogène, le sélénium est complexé à l'aide de 4-chloro-1,2-diaminobenzène. Le composé sélénié formé est extrait par du toluène et la mesure est effectuée par spectrophotométrie d'absorption atomique dans un four en graphite. Les échantillons érythrocytaires sont ceux qui servent à la mesure des taux de Na'*’ et de K'*’ (cf. 3.5.8.1.) ; les résultats tiennent compte de la présence de traces de sélénium dans la solution utilisée pour laver les hématies.

3.5. LA MEMBRANE.

3.5.1. Examens morphologiques.

Le diamètre érythrocytaire moyen est évalué sur frottis non colorés en utilisant un halomètre monochromatique (Waterfield, 1948) ; chaque lecture est faite en double par deux observateurs et la moyenne générale est calculée. L'écart entre les moyennes de chaque observateur ne dépasse jamais 0,2 /^m. Le pourcentage de cellules-cibles est évalué sur frottis non colorés par comptage de 500 hématies ; la lame est désignée par un numéro de code dont la signification est inconnue de l'observateur.

Pour la microscopie électronique à balayage du sang périphérique, deux techniques de fixation sont utilisées ; ou bien les prélèvements sont directement fixés dans du glutaraldéhyde à 1 % en tampon phosphate (0,1 M; ph 7,4), ou bien la fixation dans

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-du glutaraldéhyde à 6,5 % en tampon phosphate n'est réalisée qu'après des lavages abondants avec une solution isotonique de chlorure de sodium. Les examens sont ultérieurement réalisés par le Docteur P. Nève, dans les conditions techniques mises au point par ce dernier. Sans insister sur les diverses étapes de la désydratation dés échantillons, nous nous limitons à rappeler que, dans cette technique, les cellules sont récoltées par aspiration sur des membranes en argent poreuses et sont recouvertes d'une fine pellicule d'or avant l'observation A.

3.5.2. Résistance globulaire osmotique.

La détermination quantitative de la résistance globulaire osmotique est effectuée sans incubation préalable, en utilisant des dilutions progressives d'une solution de chlorure de sodium tamponnée à ph 7,4 par addition de tampon phosphate, selon la méthode décrite par Wintrobe (1962).

Les modifications de la résistance osmotique in vivo sont étudiées selon un protocole voisin de celui élaboré par Cooper et JandI (1968). Quinze ml de sang d'un patient sont prélevés stérilement sur 2,5 ml d'ACD"NIH" A et incubés pendant 30 minutes à la température du laboratoire en présence de 250 ^Ci de ® ‘ chromate de sodium O.

Les globules marqués sont lavés une fois en utilisant une solution isotonique stérile de chlorure de sodium, puis injectés à un adulte sain de même groupe sanguin, informé et consentant. A différents intervalles après la réinjection, on prélève chez cet adulte 20 ml de sang ; après défibrination sur billes de verre, des parties aliquotes de 0,5 ml sont introduites dans des tubes contenant 3 ml de dilutions progressives de chlorure de sodium tamponné et les tubes sont agités. Après 30 minutes les tubes sont centrifugés; 2 ml de surnageant sont décantés et servent à déterminer l'activité isotopique puis le taux d'hémoglobine.

L'activité isotopique est comptée sur le pic photoélectrique du ® ‘ Cr dans un compteur à cristal-puits □ ; les temps de comptage sont tels que l'erreur statistique relative est inférieure à 2 % avec 0,5 ml de sang du receveur.

L'activité isotopique ou le taux d'hémoglobine déterminés dans le surnageant du tube contenant 3 ml de solution osmotiquement équivalente à 0,85 g de Na Cl/100 ml sont considérés comme "blancs" et sont retranchés des valeurs observées dans les autres tubes.

Les résultats sont exprimés en pourcentages des valeurs observées dans les tubes contenant 3 ml d'eau distillée.

Cette méthode permet de déterminer simultanément la résistance osmotique des globules

A ; L'observation est réalisée au microscope électronique à balayage Cambridge Stereoscan S4-10.

O ; CEN, activité spécifique égaie à 120 mCi/M.

□ ; Appareil XL 6275/00 - 1-71.0, équipé d'un cristal de 1 3/4 pouces et connecté aux dispo­

du donneur et du receveur. Il est à noter que le sang n'est dilué que 7 fois dans les tubes à hémolyse et que l'osmolarité réelle dans chaque tube doit donc être corrigée en fonction de l'osmolarité sanguine; la formule proposée par Emerson et coll. (1956) a été utilisée dans ce but.

3.5.3. Lipides membranaires.

Dix ml de sang sont recueillis sur Na2-EDTA (1 mg/ml de sang total) et mis dans un bain de glace. Les globules sont rapidement lavés à 3 reprises dans une solution froide de tampon phosphate de pH égal à 7,4 et d'osmolarité égale à 286 milliosmoles, en éliminant la couche leucocytaire. Au culot de globules lavés on ajoute un volume ap­ proximativement égal de solution de lavage, on mélange et on détermine l'hématocrite de la suspension. Les échantillons, enrichis en dithionite (Broekhuyse, 1973), sont maintenus à —25° jusqu'au moment de l'analyse. Des observations préliminaires ont montré que les échantillons conservés de cette manière sont stables pendant au moins 5 mois.

L'extraction des lipides est faite à 2 reprises, sous azote, selon la méthode de Rose et Okiander (1965); il a été vérifié qu'une troisième extraction a un rendement nul. Deux échantillons de 2 ml de suspension d'érythrocytes sont simultanément traités : l'un servira à la détermination des taux de phospholipides et de cholestérol, l'autre à la chroma­ tographie des phospholipides; Dans le deuxième cas, l'isqprooanol est enrichi en butylhydroxy- toluène — BHT (Dodge et Phillips, 1966). Les lipides extraits sont lavés selon la technique de

Foich et coll. (1957).

Le phosphore lipidique est dosé en triple selon la méthode de Bartiett (1959) modifiée par Marinetti (1962) et le cholestérol en triple selon la méthode de Zlatkis et coll. (1953) A. En retenant les deux valeurs extrêmes de chaque groupe de 3 mesures, on peut constituer 35 doublets à partir desquels l'erreur sur les dosages peut être évaluée. Les coefficients de variation ainsi calculés sont de 2,1 % pour le phosphore lipidique et de 3,7 % pour le cholestérol. L'exactitude des mesures est vérifiée par l'étude systéma­ tique d'un plasma de référence O.

Après évaporation, l'extrait servant à la chromatographie est dissout dans du benzène- éthanol (4:1); le taux du phosphore lipidique est déterminé dans 3 prises d'essais et permet de calculer la récupération des phospholipides après la chromatographie.

A ; L'introduction récente des méthodes enzymatiques de dosage du cholestérol montre que la_spécifi-

cité des méthodes colorimétriques est imparfaite. Elles peuvent conduire à des erreurs par excès, qui sont toutefois peu importantes et sont négligées dans toutes les études du métabolisme des lipides érythrocytaires.

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-La chromatographie bidimensionnelle quantitative sur couches minces est effectuée en double selon une méthode proche de celle de Turner et Rouser (1970, a). Des pla­ ques dont l'adsorbant est composé de gel de silice et d'acétate de magnésium sont uti­ lisées A; les solvants sont, dans la première dimension : chloroforme redistillé/méthanol/ ammoniaque à 25 %, 65 : 25 : 5, et dans la seconde : chloroforme redistillé/acétone/ méthanol/acide acétique/eau, 3 : 4 : 1 : 1 : 0,5. Les phospholipides sont révélés par usage de vapeurs d'iode et identifiés en fonction de l'étude préalable de divers mélanges de standards purs O.

Les phospholipides séparés sont délimités par des cercles ou ellipses de surface connue, puis récupérés par aspiration □. Les constituants suivants sont étudiés : PC, PE, Sph, PS, PI, AP, LPC, origine, ainsi qu'un composant X de nature inconnue, ne contenant que des traces de phosphore, qui est régulièrement observé au voisinage de l'origine

(Figure 2). Ce composant pourrait être un globoside (Turner et Rouser, 1970, a). Les

dosages du phosphore sont effectués sans élution préalable ; dans le cas des constituants les moins abondants (PI, AP, LPC, origine, X), les lipides identiques provenant des deux chromatographies effectuées simultanément sont aspirés dans un même tube à essai. La quantité de phosphore par unité de surface d'adsorbant (blanc de l'adsorbant) est déter­ miné grâce à une troisième plaque développée en même temps que celles sur lesquelles ont été déposés les échantillons de l'extrait. Les résultats sont exprimés en pourcentages du phosphore total contenu dans l'ensemble des constituants séparés.

La récupération du phosphore lipidique après chromatographie est de 87,2 ± 1,4 % (n = 35). Chaque séparation chromatographique étant effectuée en double, il est possible d'évaluer l'erreur sur la méthode en ce qui concerne les constituants les plus abondants (PC, PE, Sph, PS). L'analyse statistique portant sur 35 doublets permet de calculer les coefficients de variation suivants : PC : 4,2 % ;

PE : 2,9%; Sph : 4,0 % ; PS : 2,6 % .

Il s'agit probablement là de surestimations des erreurs réelles, car nous avons postulé pour les calculs statistiques que la quantité totale de phospholipides déposée sur chacune des deux plaques était rigoureusement identique. Si le dépôt était différent, les coefficients de variation seraient élevés sans que ceci ait de répercussion sur l'expression des résultats en pourcentages du phosphore total contenu dans l'ensemble des constituants séparés.

A .• Redi-coats, Supelco, Inc.

O : Phosphoglyceride kit, Supelco, Inc.

□ .■ Le rendement de la technique d'aspiration a préalablement été déterminé en déposant sur une plaque

des échantillons connus de phosphore lipidique, puis en mesurant la quantité de phosphore récupé­ rée par aspiration. La récupération ne diffère pas de 100%.

FIGURE 2.

Exemple de chromatographie bidimensionnelle en couche mince des phospholipides érythrocytaires d'un enfant atteint de kwashiorkor marastique. Les lipides ont été révélés par pulvérisation d'un mélange de formaldéhyde à 37 % et d'acide sulfurique à 98 % (3 : 97), suivie de chauffage à 180° pendant 30 minutes.

LMP : lipides moins polaires

La LPC n'est pas visible mais son emplacement est délimité.

3.5.4. Lipides plasmatiques, vitamine E et lipoprotéines.

La concentration des lipides totaux est évaluée selon la méthode colorimétrique de Zôllner et Kirsch (1962). Pour le cholestérol et les esters du cholestérol, la méthode de Chiamori et Henry (1959) est utilisée. Le dosage des phospholipides est effectué selon Broekhuyse (1969). L'exactitude des résultats est vérifiée en utilisant un plas­ ma de référence A'.

-41-La technique utilisée pour le dosage de la vitamine E est une modification, précédem­ ment décrite (Fondu et coH., 1978) de la méthode de Kayden et coll. (1973). A la grande reproductibilité de cette dernière, notre méthode associe l'avantage d'une haute spécificité, puisqu'une correction est introduite pour tenir compte du carotène simultanément extrait. Nous avons vérifié que la teneur en vitamine E du plasma con­ servé à —25° est stable pendant plusieurs mois.

Le plasma servant à la chromatographie des phospholipides est obtenu par centrifugation immédiate de sang prélevé sur Na2 — EDTA; il est enrichi en dithionite et conservé à —25° jusqu'au moment de l'analyse.

Les méthodes d'extraction et de chromatographie sont similaires à celles décrites dans le cas des érythrocytes (Turner et Rouser, 1970, b). Les constituants suivants sont étudiés : PC, Sph, PE, LPE, PI, LPC, origine.

L'électrophorèse des lipoprotéines est effectuée sur papier, le jour même du prélèvement, selon les recommandations de Lees et Hatch (1965); cette méthode est la seule pour laquelle l'appareillage était disponible à Lwiro. Avec l'albumine humaine utilisée A, les pré-/3 et P lipoprotéines ne sont pas nettement séparées. De plus, une meilleure sépara­ tion des a et ((3 -I- pré/3) lipoprotéines est obtenue dans le kwashiorkor marastique quand la concentration en albumine est préalablement normalisée par addition d'albu­ mine humaine pure au plasma étudié. L'électrophorèse est toujours effectuée en double, les fractions équivalentes étant habituellement réunies pour le dosage des lipides. Dans 12 cas pris au hasard, les fractions ont été étudiées séparément afin de permettre d'éva­ luer l'erreur sur la méthode par l'étude des doublets : le coefficient de variation est de 4,4 % pour le pourcentage des a lipoprotéines et de 2,6 % pour le pourcentage des (0 -I- pré|3) lipoprotéines.

Le plasma servant à la séparation des lipoprotéines est obtenu par centrifugation de sang recueilli sur Na2 - EDTA ; il est ensuite enrichi en thimérosal (Hatch et Lees, 1968) et constamment conservé entre 0 et +4° jusqu'au moment de l'ultracentrifugation. La sé­ paration des VLDL, des LDL et des HDL est réalisée 15 jours au plus tard après le prélèvement, selon la méthode de Havel et coll. (1956) modifiée par Cheung et coll. (1975) O. Au cours d'essais préliminaires, les LDL séparées à partir de plasmas normaux selon cette méthode ont été étudiées par électrophorèses sur acétate de cellulose et par immunoélectrophorèses; un seul constituant a pu être mis en évidence dans ces échantil­ lons.

Les fractions séparées sont dialysées à 2 reprises (4 heures puis 20 heures) dans 200 volu­ mes de Na Cl (2g/1000ml) à 4°. Les dosages au cholestérol et des phospholipides sont

A ; Albumine humaine Mérieux à 20 7o contenant du caprylate de sodium.

effectués en double après extraction selon Broekhuyse (1969) ; les techniques de dosa­ ge sont les même que pour le plasma total. Le taux de protéines dans chaque fraction est mesuré en double par la méthode de Lowry et coll. (1951).

3.5.5. Incorporation de l'acide linoléique dans les phospholipides membranaires. 3.5.5.1. Comptages isotopiques.

Pour le comptage en scintillation liquide des phospholipides radioactifs séparés par chro­ matographie en couche mince, trois techniques sont décrites dans la littérature ;

1) la radioactivité est comptée en présence de l'adsorbant dans un gel thixotropique

(Snyder, 1970 ; Snyder et Stephen, 1962} ;

2) les phospholipides sont élués de l'adsorbant par divers solvants (Webb et Mettrick,

1971 ; Pyrovolakis et coH., 1973) ;

3) l'adsorbant est dissout par addition d'acide fuorhydrique (Shaw et coll., 1971). Des essais préliminaires effectués à Bruxelles en présence de phosphatidylcholine U - “*CA nous ont montré que le rendement et la reproductibilité de ces trois méthodes

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