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Les interactions thermostabilisantes

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23 Méthodes d’identification des différents facteurs

3.5 Propension relative d’exposition au solvant d’un résidu

4.2.1 Les interactions thermostabilisantes

Il s’agit des interactions entre paires de résidus dont la contribution énergétique évaluée par notre potentiel de distance est plus favorable (ou moins défavorable) à haute température par rapport aux autres interactions. Ces paires d’acides aminés apparaissent comme significativement plus stabilisantes au sein d’un environnement protéique thermostable que mésostable par rapport aux autres interactions. Parmi celles-ci, nous retrouvons les ponts salins, les interactions cations-ti, les interactions aromatiques, certains ponts H et interactions effectives entre certains acides aminés hydrophobes (tableaux 4.7 - 4.13). Les détails concernant toutes les interactions thermostabilisantes identifiées sont fournis en annexe (tableau A.5, fig. A.1-A.55).

Chapitre 4 — Dépendance en la température d’interactions protéiques

4.2.1.1 Les ponts salins

Comme nous l’avons montré à la section 4.1.3, ce type d’interaction présente des profils énergétiques qui apparaissent clairement plus favorable à haute température. Tout au long de nos recherches nous avons pu constater cette même tendance déjà mise en avant par d’autres

travaux En effet, relativement à d’autres interactions nous

retrouvons plusieurs profils énergétiques significativement plus favorables à haute température impliquant des paires de résidus et de regroupements de résidus entre acides aminés portant une charge positive (H, K et R) et négative (D et E). En particulier, les contributions énergétiques de la paire de regroupements de résidus [DE-KR] (fig. 4.21, tableau 4.7) dérivés à partir des deux groupes de thermostabilité croissante et

) présentent des différences significatives.

Figure 4.21 - Potentiel de distance àW^ de la paire de regroupements [DE-KR] et représentation schématique d’un pont salin entre [E-R]. Ces fonctions d’énergie sont dérivées en fonction de la distance inter-résidus d entre centres géométriques (C^-C^). Les couleurs des trois fonctions d’énergie dérivées à partir des trois groupes de protéines de la série

Qt2)BD^ correspondent à celles définies au tableau 3.11 (à savoir : ^ classés en fonction de leur résistance thermique moyenne croissante). La représentation schématique de cette interaction en montre un exemple type permettant de mieux visualiser sa géométrie ainsi que la position des de chacun des résidus (représentés par les deux sphères de couleur orange). Figure réalisée avec les logiciels XMgrace et PyMol

Nous avons calculé la probabilité d’observer une telle dissemblance parmi les contributions des mille séries aléatoires générées. Elle vaut moins d’un pourcent lorsque les résidus sont représentés par leurs centres géométriques et elle est légèrement supérieure à

Interaction

Interaction “ P.O.OI (%) ‘ P,OUl(%)'’ Cv-Cv Pmi„(%)" Pn»„(%)" Cv“Cv DE-KR 0,7 1,7 0,6 (3) 1,2(1) D-KR 5,5 / 3,1 (2) / E-KR 1,4 6,1 1,1(1) 8,5 (2) DE-R 2,4 4,6 3,4(3) 2,4 (2) D-R 8,6 5,5 4,6(1) 6,3 (1) E-R 2,6 2,5 1,1 (2) 1,9 (5) E-H / 2,7 / 3,7(1)

Tableau 4.7 -Interactions thermostabilisantes : les ponts salins. Dans cette colonne figurent toutes les interactions entre paires de résidus et/ou regroupements, celles qui sont défavorables (présentant une énergie libre positive sur l’intervalle de distance considéré) sont en italique. P,oiai et Pmin sont les probabilités (exprimées en %) qu’une différence similaire soit observée parmi les séries aléatoires, P^xai est évaluée à l’aide du critère de surface énergétique globale A,otai entre les profils énergétiques dérivés des groupes de protéines de résistance thermique moyenne distincte et P^in est évaluée à l’aide du critère de surface autour des minima d’énergie Amin (sections 3.4.3 et 3.4.4), « / » indique que les limites de significativité fixées ne sont pas atteintes (Ptoiai < 5% et Pmin <10% dans le cas de paires impliquant des regroupement d’acides aminés similaires, P,oui < 10% et Pmin <20% dans le cas de paires de résidus uniquement). La valeur Pmin affichée est la valeur de Pmi„ maximale correspondant à un des minima parmi le nombre de minima considérés qui figure entre parenthèses.

Notre nouvelle approche nous a permis d’extraire quelques différences subtiles entre les différents types de ponts salins. Premièrement, nous avons pu remarquer que la contribution énergétique thermostabilisante des ponts salins est plus marquée lorsqu’ils sont formés avec l’arginine qu’avec la lysine. En effet, les ponts salins formés avec la lysine n’apparaissent comme significativement plus stabilisants à haute température que s’ils sont regroupés avec ceux formés avec l’arginine (tableau 4.7). Ceci peut être lié d’une part à la longue chaîne latérale de la lysine présentant de grands degrés de libertés lui conférant une grande entropie et d’autre part à la particularité de la charge positive de l’arginine qui est délocalisée sur son groupement guanidinium. Deuxièmement, certains ponts salins formés avec l’histidine que nous avons négligés à la section 4.1.3 présentent également une dépendance en la température. En effet, la contribution plus stabilisante à haute température de la paire de résidus [E-H] est significative bien que moins prononcée. Cette tendance plus réservée de ces ponts salins est vraisemblablement liée à la singularité de l’histidine qui peut être chargée ou non dans des conditions physiologiques en fonction de son entourage proche. Troisièmement, l’impact de la température sur les contributions énergétiques des ponts salins formés avec l’acide glutamique est plus important qu’avec l’acide aspartique bien que les minima énergétiques de ces derniers soient plus profonds. Ceci peut être lié à la plus courte chaîne latérale de l’acide aspartique.

En outre, la représentation des résidus selon leur centre fonctionnel Cv, fournit une contribution plus stabilisante (~-l,5 kcal/mole, fig. 4.22) pour la paire de regroupements [DE-KR] que la représentation identifiant les résidus par leur centre géométrique C^ (~-0,6 kcal/mole, fig. 4.211). Cette différence peut être attribuée à la position des pseudoatomes Cv représentant avec plus de précision la position des charges que portent les chaînes latérales de ces acides aminés (schémas de droite des figures 4.21 et 4.22). De ce fait, les distances calculées entre les Cy de résidus formant un pont salin sont beaucoup plus constantes que celles observées entre leurs C^.

Chapitre 4 — Dépendance en la température d’interactions protéiques

représentation schématique d’un pont salin entre [E-R]. Ces fonctions d’énergie sont dérivées en fonction de la distance inter-résidus d entre centres géométriques (Cy-Cv). Les couleurs des quatre fonctions d’énergie dérivées à partir des quatre groupes de protéines de la série

correspondent à celles définies au tableau 3.11 (à savoir : Gf —classés en fonction de leur résistance thermique moyenne croissante). La représentation schématique de cette interaction montre un exemple type permettant de mieux visualiser sa géométrie ainsi que la position des Cy de chacun des résidus (représentés par les deux sphères de couleur magenta). Figure réalisée avec les logiciels XMgrace et PyMol

Comme nous l’avions déjà mis en évidence, les ponts salins formés avec l’arginine présentent la particularité d’avoir un profil énergétique avec deux minima (section 4.1.3.2). Ceux-ci correspondent à deux conformations géométriques différentes et ne peuvent être observés qu’entre paires de résidus et non entre regroupements de résidus similaires. En effet, bien que l’on prenne en compte la différence de la taille des chaînes latérales (section 3.2.4), le deuxième minimum n’apparaît plus car les intervalles de distances inter-résidus sont différents pour chaque acide aminé du regroupement. Il n’est pas possible de l’observer non plus avec la représentation utilisant les Cy puisque les géométries d’interaction des ponts salins pour toutes les paires présentent une distance inter-résidus Cy-Cy très proche. Dès lors tous les ponts salins sont regroupés dans un même intervalle de distance Cy-Cy. En outre, ceci renforce le fait que les contributions énergétiques dérivées pour les paires de résidus [D-R] et [E-R] sont plus profondes en utilisant les Cy que les C^.

4.2.1.2 Les interactions cation-7ü

Ce type d’interaction met en jeu un cycle aromatique et une charge positive (fig. 4.18). Parmi les vingt acides aminés constituant l’alphabet des protéines, quatre d’entre eux ont une chaîne latérale présentant un cycle aromatique (F, H, W et Y) et trois portant une charge positive (H, K et R). L’histidine a la particularité de rentrer dans ces deux catégories et nous ne l’avons donc pas incluse dans les regroupements (tableau 3.15). Les potentiels dérivés à partir des deux groupes et ainsi que du groupe de référence présentent un profond minimum à des faibles distances. Ce minimum est observé quelle que soit la représentation simplifiée utilisée (à savoir : C^ ou Cy). Cette observation atteste le rôle stabilisant inmortant des interactions cation-7i à l’énergie libre de repliement des protéines,

(fig. La paire de regroupements [KR-FWY] donnant l’appréciation la

plus globale de la dépendance en la température de ce type d’interaction montre qu’elles sont plus stabilisantes à haute température relativement aux autres interactions. En effet la

contribution énergétique de cette paire de regroupements entre résidus est plus favorable lorsqu’elle est dérivée à partir du groupe de protéines les plus thermostables. Ceci est corroboré par les écarts significatifs entre les profils énergétiques dérivés de plusieurs paires de résidus et/ou regroupements capables de former des interactions cation-7i (tableau 4.8).

Figure 4.23 - Potentiel de distance de la paire de regroupements [KR-FWY] et représentation schématique d’une interaction cation-7ü entre [R-Y]. Légende cf. figure 4.21. Interaction P,Otai (%) "

c^-c^

Cy-Cv P™„(%)"

c^-c^

Pmin(%)"Cy-Cy KR-FWY 3,7 2,8 3,1 (4) 1,6 (3) R-FWY 6,4 8,4 3,1 (2) 5,0 (3) KR-W 3,6 2,9 1,9 (3) 0,3 (1) KR-Y 3,6 3,5 1,2 (2) 1,3 (3) K-F / 0,3 / 0,8 (2) K-Y 8,9 / 3,1 (2) / R-W 1,8 / 7,3 (1) / R-Y 0,5 1,5 0,8 (2) 0,7 (4) H-F 2,6 / 0,8 (1) /

Tableau 4.8 - Interactions thermostabilisantes : les interactions cation-m Légende cf. tableau 4.7.

Les deux interactions cation-7i les plus stabilisantes thermiquement sont celles formées entre l’arginine et les acides aminés Y et W. Comme pour les ponts salins, les interactions cation-7t formées avec l’arginine ont un pouvoir thermostabilisant plus important que ceux formés avec la lysine. Cette tendance peut s’expliquer par le fait qu’en plus d’établir une interaction électrostatique avec un cycle aromatique, l’arginine peut former un empilement ji-tc avec celui-ci. En effet, la délocalisation de la charge positive de l’arginine sur son groupement guanidinium peut permettre un recouvrement de ses orbitales 7C avec celles du cycle aromatique. Il est intéressant de constater que la paire de résidus [H-F] présente également une contribution énergétique plus favorable aux températures élevées. Ces deux acides aminés peuvent interagir de plusieurs manières différentes selon que l’histidine est chargée ou non. La contribution énergétique de cette paire mélange donc plusieurs types d’interactions possibles : des interactions cation-7ü, interactions aromatiques ainsi que les interactions effectives liées à leur hydrophobicité.

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D’autre part, les interactions amino-7t se forment entre des acides aminés ayant un cycle aromatique et des acides aminés dont un groupement porte une charge positive partielle (N et Q). Leur géométrie d’interaction est la même que celle d’une interaction cation-7t cependant elles sont énergétiquement plus faibles Par ailleurs, elles ne présentent pas de dépendance en la température relativement aux autres interactions.

Il est nécessaire de prendre quelques précautions supplémentaires quant à cette dépendance en la température des interactions cation-7i que nous mettons en évidence ici. En effet, il serait risqué de prétendre que nos potentiels de distance décrivent parfaitement ces interactions. C’est d’ailleurs pour cette raison que dans la section 4.1.5 nous avons utilisé un autre potentiel statistique plus adapté à leur géométrie d’interaction particulière. Ainsi, nos potentiels de distance dérivés de ces paires de résidus, prennent en compte plus d’un type d’interaction que simplement les interactions cation-7i éventuelles {e.g. ponts H, effet hydrophobe ...). Cependant, bien que nous ne puissions estimer quel est le poids des interactions cation-jc dans cette dépendance en la température que nous observons, leur plus grande abondance au sein de protéines thermostables observée à plusieurs reprises corrobore

[91,99,103,164f notre interprétation

4.2.1.3 Les interactions aromatiques

Comme nous l’avions constaté dans la section 4.1.4, le faible pourcentage général des acides aminés aromatiques F, W et Y au sein des protéines rend l’étude des interactions aromatiques entre paires de résidus plus difficile. D’autre part, le fait que deux résidus aromatiques puissent interagir de plusieurs manières différentes complexifie davantage leur analyse. En effet, en fonction de leur positionnement respectif, ceux-ci peuvent former des empilements 7i-7i ou des interactions de nature électrostatique (fig. 4.16). Il faut également considérer leur aptitude à former une interaction effective entre leurs chaînes latérales hydrophobes sans oublier que Y et W ont la possibilité de former des ponts H entre eux. C’est ce mélange d’interactions diverses que nos potentiels de distance considèrent simultanément. Quoiqu’il en soit, à la section 4.1.4 nous avions obtenu un premier résultat qualitatif mettant en évidence le caractère plus stabilisant de ces interactions à basse température. Cependant, ces observations n’étaient faites que sur un ensemble restreint de protéines et ne concernaient que deux paires de résidus sur six (à savoir : [F-F] et [F-Y]).

Notre nouvelle approche systématique se basant sur un échantillon de protéines plus grand et mettant en œuvre un nouveau potentiel tenant compte de l’adaptation de composition des protéines thermostables montre une dépendance inverse en la température de ce type d’interactions (fig. 4.24). En effet, celles-ci apparaissent comme étant significativement plus favorables à haute température (tableau 4.9). Ce résultat contradictoire jivec notre précédente analyse (section 4.1.4) est cependant en accord avec l’observation récurrente d’interactions aromatiques plus abondantes au sein de protéines thermostables [^’i56-i60,296]

Figure 4.24 - Potentiel de distance de la paire de résidus [F-W] et représentation schématique d’une interaction aromatique entre ce couple de résidus. Légende cf. figure

4.21.

Nous sommes parvenus ici à contourner l’obstacle de la faible abondance des résidus aromatiques rencontrés lors de notre précédente analyse d’une part grâce au plus grand échantillon de protéines mais également en regroupant ces trois acides aminés entre eux [F-FWY]. En outre, la paire de résidus [F-W] montre également des écarts significatifs entre ses profils énergétiques corroborant cette dépendance en la température.

Interaction “ P,oUü(%)' Cji-Cn P.oml(%)* Cy-Cv Pnün(%)"

c^-c^

Pmin (%) " Cy-Cy F-FWY 8,0 8,2 7,5 (1) 9,4(1) F-W 1,5 2,3 2,2 (2) 4,2 (2)

Tableau 4.9 - Interactions thermostabilisantes : les interactions aromatiques. Légende cf.

tableau 4.7.

Comme pour les interactions cation-7ü, ces interactions aromatiques ne peuvent être parfaitement décrites par nos potentiels de distance. Il serait dès lors intéressant d’utiliser d’autres potentiels statistiques plus adaptés à la description de ces interactions. En outre, une étude plus approfondie sur la géométrie d’interaction de ces paires de résidus aromatiques pourrait ouvrir de nouvelles pistes.

4.2.1.4 Les interactions entre résidus chargés négativement et résidu aromatiques (Wet Y)

Un autre type d’interaction entre paires de résidus s’avérant plus favorable à haute température semble se former entre un résidu portant une charge négative D et E et les résidus aromatiques W et Y (tableau 4.10, fig. 4.25). La dépendance inverse peut être constatée lorsque le partenaire aromatique est la phénylalanine. En effet, la contribution énergétique effective dérivée pour la paire [DE-F] à partir de nos deux groupes est significativement plus favorable à haute température (section 4.2.2.3).

Chapitre 4 — Dépendance en la température d’interactions protéiques

Interaction" P.oui(%)" P.OU1 (%) *

Cy-Cy Pmi„(%)'

c^-c^

Pmin(%)" Cy-Cy DE-W 4,1 1,2 2,6 (5) 0,7 (2) DE-Y 3,3 6,1 1,2 (4) 1,1 (2) D-W 6,0 / 1,4(1) / D-Y 8,5 / 0,8 (5) /

Tableau 4.10 - Interactions thermostabilisantes : entre résidus chargés négativement et résidus aromatiques (W et Y).Légende cf. tableau 4.7.

Ce résultat suggère que l’aromaticité des résidus W, Y et F n’est pas déterminante quant à la dépendance thermique de leur interaction avec les acides aspartiques et glutamiques. Il semblerait en effet que la plus grande polarité des résidus W et Y par rapport à F joue un rôle plus important ainsi que leur capacité à former des ponts H. L’inspection de la géométrie de plusieurs paires de résidus [DE-WY] séparés par des distances spatiales correspondant au minimum énergétique de leur contribution (que ce soit en utilisant les représentations des centres géométriques ou fonctionnels des résidus Cy) montre qu’elles adoptent une conformation où la chaîne latérale des résidus D ou E est dans le plan du cycle aromatique des résidus W ou Y. Cette géométrie comble le manque d’électrons dans le plan du cycle aromatique (fig. 3.7). Elle peut également conduire à la formation d’un pont H avec la fonction alcool de Y (atome O^) et la fonction amine de W (atome N^;). Ce type de ponts H pourrait dès lors être considéré comme favorisant la thermostabilité des protéines.

Figure 4.25 - Potentiel de distance de la paire de regroupement/résidu [DE-Y] et représentation schématique d’un pont H s’établissant entre [D-Y], Légende cf. figure 4.22.

4.2.1.5 Les interactions entre résidus chargés et de petite taille

Notre nouvelle approche systématique se penchant sur chaque paire de résidus possible et regroupant des résidus similaires a mis en évidence la dépendance thermique d’interactions entre résidus de petite taille (A ou G) et résidus chargés (D, E, K ou R). En effet, leurs contributions énergétiques sont significativement plus favorables à haute température. Cependant, la contribution énergétique de ces interactions n’est pas particulièrement favorable au repliement des protéines de manière générale. En effet, nos résultats montrent que leur

contribution est généralement faiblement stabilisante et s’avère même parfois déstabilisante quelle que soit la distance séparant ces deux types d’acides aminés. La différence que nous observons entre protéines thermostables et mésostables permet de conclure que ces interactions sont en fait moins néfastes à la stabilité du repliement d’une protéine à haute température. Interaction" Ptoud (%) * Cji-Cji P.OUü(%)'’ Cv-Cv Pmi„(%)" c^-c^ Pnün (%)" Cv-Cv AG-KR 1,2 1,4 0,7 (1) 0,3 (2) G-KR 3,1 1,1 5,8 (2) <0,1 (2) AG-R 0,4 4,0 0,7 (3) 0,6(1) G-H 9,1 5,8 8,1 (1) 6,1 (1) G-R 2,8 5,7 0,5 (5) 0,4(1) AGE 8,2 / 6,8 (1) / A-E 0,8 / 0,4(2) /

Tableau 4.11 - Interactions thermostabilisantes : entre résidus chargés et de petite taille.

Légende cf. tableau 4.7.

4.2.1.6 Les interactions impliquant les résidus I, C ou M

n semblerait que dans certains cas le caractère thermostabilisant d’une interaction entre deux résidus soit plus intimement lié à un seul des partenaires. En effet, les contributions des interactions dont l’un des partenaires est l’isoleucine, la cystéine ou la méthionine sont plus favorables à haute température relativement aux autres interactions (tableau 4.12). La variation de la composition en acides aminés peut partiellement expliquer ce phénomène (tableau 3.12). En effet, notre potentiel de distance tient compte de l’adaptation de composition des protéines thermostables. Le taux plus élevé de ces trois acides aminés au sein du groupe de protéines plus thermostable influence donc en partie l’allure de leurs contributions énergétiques dérivées à l’aide de notre potentiel.

Interactions

Interaction" P.oml(%)* Ptotall^fc)" Pmi„(%)" Pmin(%)"

thermostabilisantes Cj.-Cn Cv-Cv C^-C^ Cv-Cv C-AILV 9,7 / 5,7 (3) / C -AG / 7,8 / 9,1 (3) Cystéine C-G 2,4 5,6 9,0 (2) 2,6 (4) C-FWY 0,4 0,8 0,2 (2) 0,4(3) C - NQST 7,8 / 9,7 (2) / I - AILV 1,0 0,8 2,1 (2) 0,9 (1) I-I 0,2 0,2 0,1 (4) 0,1 (5) I-AG 2,6 1,9 3,0 (2) 6,1 (3) Isoleucine I-A 0,1 0,1 1,7 (2) 1,8 (2) I-FWY / 4,1 / 1,2 (3) I-W 5,6 4,2 0,7 (1) 0,6(1) I-Y 3,7 3,8 4,6 (2) 4,3(1) M-KR 3,7 1,2 4,4(1) 4,5 (2) M-DE / 3,5 / 4,9 (3) Méthionine M-FWY 7,6 6,3 7,0 (2) 5,1 (1) M-Y 6,60 6,10 2,2(1) 2,6(1) M-A 1,1 1,2 2,1 (3) 1,7 (3)

Tableau 4.12 - Interactions thermostabilisantes impliquant les résidus I, C ou M. Légende cf. tableau 4.7.

Chapitre 4 - Dépendance en la température d’interactions protéiques

Le caractère particulier des interactions effectives entre un acide aminé hydrophobe et l’isoleucine mis en évidence à la section précédente est encore plus marqué ici. En effet, les interactions entre l’isoleucine et des résidus hydrophobes et/ou de petite taille ont une contribution significativement plus favorable au sein de protéines thermorésistantes (tableau 4.12). A nouveau cette tendance n’est pas observée lorsque l’on considère les acides aminés L et V pourtant fort proches de l’isoleucine. D’ailleurs, la dépendance thermique inverse est observée pour les interactions formées avec la leucine (section 4.2.2.6). La différence en composition de ces trois acides aminés hydrophobes aliphatiques au sein de nos groupes de protéines de résistance thermique distincte semble dépendre de leur hydrophobicité. En effet, plus la chaîne latérale d’un résidu est hydrophobe, plus la fréquence de celui-ci est importante au sein du groupe de protéines les plus thermostables (tableau 3.12). Certaines échelles d’hydrophobicité classent ces trois acides aminés de la manière suivante : l’isoleucine est plus hydrophobe que la valine qui est elle-même plus hydrophobe que la leucine Les échelles d’hydrophobicité citées ici correspondent à des moyennes effectuées d’une part sur des données expérimentales évaluant les énergies libres de transfert d’un résidu entre diverses phases et/ou solvants, et d’autre part sur des données relatives à leur abondance en surface et au cœur des protéines. Ces valeurs moyennes ont pour objectif de permettre de mieux décrire l’hydrophobicité de la chaîne latérale d’un résidu dans un environnement protéique que ne le font les énergies de transfert entre l’eau et un solvant apolaire {e.g. éthanol, octanol...).

Le tableau 3.12 affichant le pourcentage d’acides aminés au sein de chaque groupe montre que l’abondance d’isoleucine est plus élevée dans le groupe de protéines plus thermostables à l’inverse de la leucine plus abondante dans l’autre groupe. Quant à la valine, elle est aussi abondante dans les deux groupes. Cette corrélation entre l’hydrophobicité d’un résidu et son abondance au sein de protéines thermorésistantes suggère qu’une plus grande hydrophobicité est bénéfique à la stabilité thermique des protéines. Afin d’expliquer cette corrélation, il est nécessaire de prendre en compte la perte d’entropie défavorable d’une protéine dans son état dénaturé causée par l’exposition au solvant (solvatation) de résidus hydrophobes. Cette perte d’entropie est d’autant plus importante que l’hydrophobicité du résidu solvaté est grande et contribue d’autant plus à la stabilité de l’état replié de la protéine. Dès lors, les valeurs d’hydrophobicité reprises ici suggèrent que le remplacement des acides aminés L et V par I augmente la stabilité thermodynamique et thermique des protéines en stabilisant leur cœur

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