Intégration du signal de la titration

L’ajout successif de la solution de protéine Hsp12 entraine l’apparition de pics négatifs (Figure 62A). Il y a donc bien une interaction entre la protéine Hsp12 et le PiP2 et cette interaction est exothermique. L’intégration des pics successifs permet de calculer une

154 constante d’affinité de 2,6 µM (Figure 62B). Il y a donc une forte affinité entre la protéine Hsp12 et le PiP2.

L’ITC a permis de valider l’interaction entre la protéine Hsp12 et le PiP2 et de montrer une forte affinité entre les deux partenaires. Afin de voir si cette interaction a un impact sur les lipides, des expériences de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) sont réalisées.

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8 DSC

La calorimétrie différentielle à balayage (Differentiel Scanning Calorimetry – DSC) est une technique de calorimétrie permettant de mesurer des différences de chaleur entre une référence et un échantillon lors du balayage d’une rampe de température. Les liposomes sont caractérisés par leur température de transition de phase (Tm), ainsi que par l’enthalpie de cette transition ( H), traduisant un changement d’état des lipides. L’impact de la protéine Hsp12 sur ces deux paramètres est donc évalué. Une suspension de MLVs de DPPC-PiP2 a ainsi été utilisée à une concentration de 1,3 mM. La protéine Hsp12 a été ajoutée à une concentration de 16 µM. Les signaux obtenus pour les MLVs de DPPC-PiP2 seuls et avec la protéine Hsp12 sont montrés ci-dessous (Figure 63).

Figure 63 : Thermogramme d’analyse de liposomes de DPPC-PiP2 avec et sans la protéine Hsp12.

La température de transition de phase du mélange DPPC-PiP2 est de 38°C et l’aire du pic est de 1441 µV/s. La température de transition du DPPC seul est de 41°C donc le PiP2

influence légèrement la température de transition. Lorsque la protéine Hsp12 est ajoutée, la température de transition est augmentée d’1°C à 39°C. Ce qui signifie qu’il faut une

156 température plus importante (plus d’énergie) pour faire passer les lipides de la phase gel à la phase fluide. Il apparait donc que la protéine Hsp12 rigidifie les liposomes de DPPC-PiP2. De plus, l’aire du pic est fortement diminuée à 920 µV/s. L’aire du pic étant corrélée à l’enthalpie de la transition, la diminution de l’aire du pic signifie que le changement d’état libère moins d’énergie. Par conséquent, la protéine perturbe les chaines d’acide gras en diminuant leurs interactions de van der Waals. Il semblerait donc que la protéine Hsp12 s’intercale entre les chaines d’acide gras des lipides.

La DSC a permis de démontrer que l’interaction de la protéine Hsp12 avec des liposomes de DPPC-PiP2 entraine une rigidification de la bicouche lipidique. Ce phénomène avait également été observé avec des liposomes de DPPG (Welker et al., 2010). De plus, il semblerait que la protéine s’enchâsse dans la bicouche lipidique. Cette observation corrobore les prédictions réalisées à partir de la structure de la protéine Hsp12 dans la littérature (Herbert et al., 2012) (cf. Chapitre 1 - 1.2.2 Structure). Les hélices pourraient alors être en partie enchâssées dans la bicouche lipidique grâce aux résidus hydrophobes et les charges positives pourraient être liées par des interactions électrostatiques aux têtes des phospholipides chargées négativement (PiP2).

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9 Conclusion

Les différentes techniques utilisées ont permis de confirmer que la protéine Hsp12 native est une protéine intrinsèquement non ordonnée (IDP). En effet, la protéine Hsp12 présente une stabilité thermique jusqu’à 100°C et une mobilité électrophorétique particulière. De plus, un comportement particulier de la protéine Hsp12 a été observé en chromatographie d’exclusion stérique suggérant que la protéine Hsp12 pouvait être sous forme oligomérique. Des études de réticulation chimique ont permis de montrer l’absence d’oligomères. Le comportement de la protéine Hsp12 s’explique donc par sa forme linéaire, caractéristique des protéines IDP. Ceci a été confirmé par le dichroïsme circulaire, qui a montré que la protéine Hsp12 n’est pas structurée en solution aqueuse mais peut former des hélices en présence de SDS ainsi qu’en présence de certains phospholipides présents dans la membrane plasmique des levures, comme le PiP2. Afin de caractériser cette interaction, des expériences d’ITC ont été réalisées. Elles ont permis de démontrer une forte affinité entre la protéine Hsp12 et le PiP2 avec une constante d’affinité de 2,6 µM. Enfin, l’impact de la protéine Hsp12 sur l’organisation des lipides a été évalué grâce à la DSC. Il a ainsi été montré que la protéine Hsp12 rigidifie la bicouche lipidique de DPPC-PiP2 et qu’elle pourrait s’enchâsser dans cette bicouche.

Ces observations peuvent être extrapolées à la levure. En effet, chez la levure les esters de phosphatidylinositol (PI) sont présents majoritairement dans le feuillet interne de la membrane plasmique mais également dans les membranes de l’appareil de Golgi, des endosomes et des vacuoles (Strahl and Thorner, 2007). Une fois la protéine Hsp12 traduite dans le cytosol, elle pourrait alors interagir avec les PI et s’enchâsser en partie dans les membranes. Sa présence dans les membranes permettrait alors de les rigidifier. Cette rigidification pourrait ainsi permettre aux levures de mieux résister aux conditions stressantes en conservant l’intégrité de leurs membranes. La protéine Hsp12 aurait donc un véritable rôle de chaperonne de membrane.

Afin de mieux comprendre le rôle de la protéine Hsp12 sur les membranes, il est envisagé de localiser la protéine Hsp12 in vivo par immunofluorescence. Grâce aux anticorps anti-Hsp12 obtenus pour le développement du dosage ELISA, il est possible de cibler la protéine Hsp12 directement sur des coupes de levures. Cette étude permettrait ainsi de voir

158 la localisation de la protéine Hsp12. De plus, la détection de la protéine Hsp12 pourrait être réalisée suite aux différentes conditions de stress explorées précédemment afin de voir s’il y a une localisation préférentielle de la protéine lors de stress.

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Partie II. Caractérisation organoleptique