Matériels et Méthodes

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Chapitre 5 : Etude et maîtrise des interactions entre substrats dans les filières de co-digestion

2. Matériels et Méthodes

CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

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1. Mises au point pour l’analyse des co-produits graisseux

Les coproduits graisseux (graisses de flottation, déchets de viande…) sont des échantillons qui n’ont jamais été spécifiquement analysés dans le laboratoire du Cemagref de Rennes. Ainsi, des travaux préliminaires ont été nécessaires pour mettre au point certaines méthodes ou adapter des protocoles existants.

1.1. Analyse de la Demande Chimique en Oxygène (DCO) des co-produits graisseux

Les spécificités des co-produits graisseux posent deux principaux problèmes pour l’analyse de leur DCO (Canler, 20016) :

Les graisses sont des composés insolubles dans l’eau. Elles sont donc difficiles à diluer et à homogénéiser ce qui induit des coefficients de variation (CV) importants sur des analyses en triplicats.

La non-solubilité des graisses les rend difficilement accessibles à l’oxydant hydrophile.

Ainsi, la DCO des graisses peut être sous-estimée.

Pour palier à ces problèmes, Canler (2001) recommande de saponifier les échantillons avant analyse. Cette méthode a donc été mise en place (sur la base de méthodes développées par les équipes du Cemagref de Lyon) et testée sur les substrats graisseux collectés dans le cadre de ce travail de thèse.

La saponification est, dans un cadre général, une réaction chimique transformant un ester en un ion carboxylate et un alcool. Au cours de cette réaction, les corps gras (tri, di ou mono-glycérides) sont hydrolysés en milieu alcalin par une base, généralement de la potasse (KOH) ou de la soude (NaOH), à une température comprise entre 60 C et 100 °C. La température élevée sert à accélérer la réaction de saponification.

6 Canler J.P. 2001. Performances des systèmes de traitement biologique aérobie des graisses. FNDAE n°24. 50p.

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Il existe plusieurs procédés de mise en œuvre de saponification. Dans notre cas, 5ml de soude à 32% sont ajoutés à 40g d’échantillon. Le mélange est complété à 100ml avec de l’eau distillée pour assurer une agitation satisfaisante. Le pH est contrôlé, il doit être proche de 14. Le mélange est mis à chauffer à 60°C sur un plateau de chauffe avec agitation magnétique durant 30 minutes. On vérifie que la saponification a bien lieu (moussage + solubilisation visuelle) et à défaut, on rajoute de la soude.

La DCO de l’échantillon est ensuite déterminée par la méthode classique. Pour le calcul de la DCO de l’échantillon initial, le taux de dilution lié aux ajouts de soude et d’eau ainsi qu’à l’évaporation d’eau durant la chauffe est pris en compte.

L’intérêt de la saponification a été testé sur trois échantillons de co-produits graisseux.

Les résultats sont présentés en Table 10.

DCO

saponification 293,16 58,08 17,81 avec

saponification 278,74 11,67 4,19 Graisse de

flottation charcutière

2

sans

saponification 282,29 30,50 10,80 avec

saponification 343,49 17,41 5,07 Graisses de

station d’épuration

sans

saponification 204,76 23,78 11,61 avec

saponification 247,33 15,87 6,42

Table 10 : Résultats des tests comparatifs d'analyse de DCO sur échantillons saponifiés ou non.

On peut tirer les deux conclusions suivantes des tests effectués :

Les CV obtenus sur les analyses en triplicats sont significativement diminués grâce à la saponification (de 10 à 18% sans saponification à entre 4 et 6% après saponification). Ceci est lié à la solubilisation des graisses lors de la saponification. Cette dernière augmente l’homogénéïté de l’échantillon et facilite sa dilution lors des prises d’essais.

La valeur de DCO obtenue après saponification est en général (dans 2 cas sur 3) supérieure à celle obtenue sur l’échantillon brut. Ainsi, sauf pour les graisses de flottation

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essentiellement lié à la non solubilité des graisses qui les rend difficilement accessibles à l’oxydant.

Ainsi, la saponification des co-produits graisseux avant l’analyse de la DCO permet à la fois d’améliorer la justesse de la mesure et sa précision. Cette méthode sera donc adoptée au cours de ces travaux pour analyser la DCO des substrats gras.

1.2. Analyse de la teneur en lipides des substrats graisseux

Les teneurs en lipides totaux des substrats graisseux ont été assimilées aux Matières Extractibles à l’Hexane (MEH) qui sont mesurées grâce à une extraction Soxhlet. Ce type d’extraction est utilisé pour extraire les composés organiques d’une phase solide. Ici les composés lipidiques contenus dans la phase solide du substrat analysé seront extraits dans un solvant hydrophobe.

Un extracteur de type Soxhlet a donc été utilisé avec le montage présenté en Figure 15.

Dans le montage, l’extracteur est placé sur un ballon chauffé contenant le solvant d’extraction. Le réfrigérant inséré au dessus de l’extracteur condense les vapeurs de solvant.

L’échantillon solide est placé dans une cartouche poreuse (cartouche en cellulose de 1mm d’épaisseur) et baigne en continu dans le solvant chauffé. En effet, les vapeurs de solvant passent par le tube adducteur, se condensent dans le réfrigérant et retombent dans le corps de l’extracteur, faisant ainsi macérer le solide dans le solvant, lui-même chauffé par les vapeurs de solvants se trouvant en dessous. Le solvant condensé s’accumule dans l’extracteur jusqu’à atteindre le sommet du tube-siphon, qui provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagné des substances extraites, et le solvant contenu dans le ballon s’enrichit donc progressivement en composés extraits.

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Figure 15 : Extracteur Soxhlet (à gauche) et montage associé (à droite) pour l'extraction à chaud des substances lipidiques.

Dans le montage, l’extracteur est placé sur un ballon contenant le solvant d’extraction.

Le réfrigérant inséré au dessus de l’extracteur condense les vapeurs de solvant. L’échantillon solide est placé dans une cartouche poreuse (cartouche en cellulose de 1mm d’épaisseur) et baigne en continu dans le solvant chauffé. En effet, les vapeurs de solvant passent par le tube adducteur, se condensent dans le réfrigérant et retombent dans le corps de l’extracteur, faisant ainsi macérer le solide dans le solvant, lui-même chauffé par les vapeurs de solvants se trouvant en dessous. Le solvant condensé s’accumule dans l’extracteur jusqu’à atteindre le sommet du tube-siphon, qui provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagné des substances extraites, et le solvant contenu dans le ballon s’enrichit donc progressivement en composés extraits.

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L’avantage de ce procédé est que le cycle peut se répéter indéfiniment, jusqu’à épuisement complet de ce que l’on désire extraire.

Ainsi, pour l’analyse de la teneur en lipides des substrats étudiés, les échantillons ont été préalablement séchés et broyés (1mm) ou hachés (2mm). 5g d’échantillon sont ensuite placés dans la cartouche d’extraction. Puis, les cycles d’extraction sont réalisés avec 200ml d’un solvant organique constitué d’hexane et d’isopropanol (3/2 en volume). L’isopropanol est utilisé pour extraire les lipides amphiphile comme les phospholipides). Après un certain temps d’extraction, Les MEH du substrat se retrouvent toutes dans le ballon avec le solvant.

Le solvant est évaporé dans un évaporateur puis mis à 105°C durant au moins 12h. La quantité sèche de MEH est ensuite déterminée par gravimétrie et ramenée à la quantité de matières sèches introduite initialement dans la cartouche.

Différents temps d’extraction ont été testés pour s’assurer d’un rendement d’extraction suffisant au regard des propriétés des échantillons étudiés dans le cadre de ce travail de thèse.

Ainsi, différents temps d’extraction compris entre 1,5h et 6h ont été testés sur un échantillon de graisses de flottation charcutières et un échantillon de refus de tamisage d’un abattoir porcin. Les résultats sont présentés en Table 11.

Temps (heures) 1,5 3 5 6

Refus de tamisage

(% de MS) 18 24.2 27 26,4 Graisses de flottation

(% de MS) 91 93 88 -

Table 11: Teneurs en MEH obtenus pour deux substrats et différentes durées d'extraction.

Pour les graisses de flottation une durée d’extraction de 1,5h est suffisante. En revanche, pour les refus de tamisage, la quantité de MEH extraite varie lorsque la durée d’extraction est inférieure à 5h. Ainsi, au cours des analyses de MEH, une durée d’extraction de 5h sera systématiquement choisie pour maximiser les rendements d’extraction.

Au cours des travaux de caractérisation des substrats, la concentration en MEH des substrats a été assimilée à leur concentration en lipides totaux.

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1.3. Analyse des Acides Gras longues Chaîne (AGLC)

Les AGLC sont d’abord extraits de l’échantillon analysé puis quantifiés par chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). Cet équipement est équipé d’une colonne PLRP-S avec phase inverse (25cm, 4,6mm de diamètres, pores de 5 angströms, particules de 5µm). Les AGLC séparés par cette colonne sont détectés avec un DEDL (détecteur évaporatif à diffusion de lumière).

Pour la quantification des AGLC, la méthode d’analyse a été étalonnée sur 5 acides gras qui sont les plus courants : l’acide oléique (C18 :1), l’acide linoleïque (C18 :2), l’acide stéarique (C18 :0), l’acide palmitique (C16 :0) et l’acide palmitoléïque (C16 :1).

Pour vérifier la justesse de la méthode, des ajouts dosés ont été effectués pour calculer les rendements globaux de la méthode d’extraction et de quantification. Pour cela, des ajouts d’un mélange d’AGLC commercial (principalement constitué d’acide oléique, d’acide linoléique et d’acide palmitoléique ; Sigma-Aldrich, réf.27728) ont été effectués dans un échantillon de graisses de flottation charcutières. Les ajouts dosés représentent respectivement 15, 30 et 60% des MEH des graisses de flottation utilisées.

Deux méthodes d’extraction ont été testées. La première (« méthode avec séchage à 105°C » sur les graphes) est effectuée après séchage à 105°C et extraction par Soxhlet dans un solvant constitué d’hexane et d’isopropanol (3/2) (méthode décrite en 1.2.). Cette méthode est uniquement applicable à des échantillons secs. La seconde méthode (« méthode sans séchage à 105°C » sur les graphes) consiste en une simple extraction à chaud sur l’échantillon brut. Ce dernier (40g) est mis au contact du même solvant (200ml) dans un ballon et porté à ébullition à reflux durant 5h. Le mélange est ensuite filtré (cartouche en cellulose de 1mm d’épaisseur) puis analysé en HPLC (si deux phases apparaissent du fait de la non solubilité de l’eau dans le solvant organique, les deux phases sont analysées séparément et prises en compte dans les calculs).

Les résultats obtenus en termes de concentrations en chaque AGLC mesurées en fonction des concentrations théoriques sont présentés en Figure 16 pour l’acide oléique, en Figure 17 pour l’acide linoléique et en Figure 18 pour l’acide palmitoléique.

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y = 0.3598x

Figure 16: Concentration en acide oléique mesurée en fonction de la concentration théorique pour les différents ajouts dosés effectués.

y = 0.6511x

Figure 17: Concentration en acide linoléique mesurée en fonction de la concentration théorique pour les différents ajouts dosés effectués.

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y = 0.4405x

Figure 18: Concentration en acide palmitoléique mesurée en fonction de la concentration théorique pour les différents ajouts dosés effectués.

Sur ces bases, les rendements globaux peuvent être estimés pour les deux méthodes étudiées et sont présentés en Table 12.

Rendement

Table 12: Bilan des rendements d'analyse obtenus pour les trois AGLC étudiés et les deux méthodes utilisées.

On observe que les rendements obtenus pour la méthode d’extraction « avec séchage à 105°C» sont faibles (entre 36 et 65%). En revanche, avec la méthode d’extraction sur échantillon brut (« sans séchage à 105°C »), les rendements sont satisfaisants (entre 94 et 114%). Les faibles rendements obtenus avec la première méthode sont sans doute liés à des

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transformations des AGLC durant les 48h de séchage à 105°C (raccourcissement des chaînes carbonées par exemple).

Bien que la méthode d’analyse par HPLC ait été étalonnée sur l’acide stéarique et l’acide palmitique, il n’est pas possible de statuer quant au rendement d’analyse sur ces deux AGLC. En effet, la solution commerciale utilisée en contient mais dans des concentrations trop faibles au vu de la précision des analyses.

En conclusion, lors des analyses d’AGLC, la méthode d’extraction sur échantillon brut (« sans séchage à105°C ») sera utilisée.

2. Outils expérimentaux pour l’étude de la biodégradabilité anaérobie des substrats

2.1. Détermination des potentiels méthanogènes

2.1.1. Méthode

La mesure de potentiel méthanogène (Biochemical Methanogenic Potential ou BMP) permet de déterminer la biodégradabilité anaérobie maximale de la matière organique d’un substrat et la production de méthane maximale associée. Réalisé en anaérobiose, le test de potentiel méthanogène est basé sur la mesure de la production de biogaz dans un flacon à sérum fermé (batch) de volume total de 330ml, en présence d’inoculum (dans le cadre de cette étude 30g), de substrat (ratio substrat/inoculum : 1gDCOsubstrat_biodégradable/gDCOinoculum sauf pour les substrats graisseux pour lesquels un ratio de 0,3gDCOsubstrat_biodégradable/gDCOinoculum a été appliqué) et d’une solution nutritive (Hach©, BOD Nutrient Buffer Pillows) pour compléter à 100g la masse totale de liquide dans le flacon. Comme le montre la Figure 19, le flacon est fermé avec un septum en caoutchouc butyle et serti avec une bague à vis. Puis un renouvellement de l’atmosphère de l’espace de tête est effectué avec de l’azote pour que le mélange substrat-inoculum-solution nutritive soit mis en conditions anaérobies.

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Figure 19: Flacons utilisés pour les tests BMP (à gauche) ainsi que manomètre et seringue utilisés pour la mesure de la pression et le prélèvement gazeux (à droite).

Ensuite, les flacons sont mis à incuber à 38°C dans une enceinte thermostatée pendant 30 à 50jours selon les substrats étudiés. Durant l’incubation, les productions gazeuses sont suivies régulièrement en fonction de l’intensité de la production. Le suivi quantitatif de la production de biogaz est effectué à partir des variations de pression dans l’espace de tête mesurées au moyen d’un manomètre manuel (Digitron© 2085P). On réalise un prélèvement de gaz lorsque la surpression atteint 1300 mbar. Pour cela, un échantillon de 10 à 15 ml du ciel gazeux est prélevé au moyen d’une seringue à gaz. Cet échantillon est ensuite placé dans un vial de 2ml puis est analysé en chromatographie gazeuse (équipée d’un détecteur de ionisation de flamme) pour connaître les proportions de méthane et dioxyde de carbone dans le biogaz produit. Après le prélèvement, la pression du flacon est équilibrée avec la pression atmosphérique à l’aide d’une aiguille permettant l’échappement du surplus de gaz.

Chaque mesure est réalisée en triplicats. Chaque série de test est réalisée en parallèle d’un test sans ajout de substrat (blanc) qui permet d’estimer la production de biogaz liée à la dégradation résiduelle de l’inoculum. Ensuite, par différence entre la production de méthane (ou de biogaz) cumulée des tests avec substrat avec celle des tests blancs, le potentiel méthanogène (ou biogaz) du substrat étudié est calculé.

2.1.2. Précision de la mesure

Notamment du fait de la quantité importante de paramètres mesurés et de la multiplicité des prélèvements de gaz notamment, cette mesure reste assez sensible et soumise à un risque d’erreur important. Ainsi, l’erreur maximale sur la valeur du BMP a été calculée dans le cadre du protocole analytique appliqué au Cemagref de Rennes. Cette dernière a été calculée avec deux méthodes de calcul du BMP distinctes :

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Méthode 1 (M1) : A chaque prélèvement de biogaz, la quantité de méthane exactement produit depuis le dernier prélèvement est calculée. Puis ces quantités sont sommées à la fin du test.

Méthode 2 (M2) : A chaque prélèvement de biogaz, la quantité de biogaz produite depuis le dernier prélèvement est estimée. Pour estimer le méthane produit, on applique, à la principale différence avec la méthode 1 réside dans le fait que les erreurs sur la quantité de méthane présente dans l’espace de tête du flacon n’entre pas en ligne de compte.

Cependant, du fait de cette approximation, une erreur supérieure sur la mesure doit être considérée.

En utilisant ces deux méthodes, les erreurs maximales sur la mesure du potentiel méthanogène ont été calculées en considérant les erreurs maximales sur paramètres mesurés décrites dans la Table 13.

Masse d’inoculum et d’eau 0,05g Matière organique 5% de la valeur

Table 13: Erreurs absolues maximales sur les paramètres mesurés pour le calcul du potentiel méthanogène.

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15%

Figure 20: Part de l'erreur totale induite par chaque paramètre mesuré pour les méthodes de calcul 1 et 2 (en % de l’erreur maximale totale).

Ces chiffres, s’ils permettent de comparer les deux méthodes, sont néanmoins à relativiser quant à l’erreur réelle sur la mesure du potentiel méthanogène qui est forcément inférieure à cette donnée théorique du fait, d’une part, que pour chaque erreur de mesure, il s’agit d’une erreur maximale et d’autre part, que les effets antagonistes sur les différentes erreurs ne sont pas pris en compte dans le calcul. Pour minimiser au mieux l’erreur sur la valeur de potentiel méthanogène mesurée, la méthode de calcul 2 sera appliquée lors de nos travaux.

2.1.3. Estimation de la biodégradabilité des substrats

Le potentiel méthanogène peut être utilisé pour calculer une biodégradabilité de la DCO des substrats. Ainsi, sachant qu’en théorie, 1gDCO dégradé conduit à la production de 350Nml de méthane et en négligeant donc l’utilisation de matière organique par les micro-organismes pour leur anabolisme. On obtient l’Equation 1 qui permet de calculer la biodégradabilité de la DCO totale des substrats :

Biodégradabilité 100

Equation 1 : Calcul de la biodégradabilité de la DCO totale des substrats.

Méthode 1 Méthode 2

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Selon le même principe, la biodégradabilité peut être calculée sur le carbone total.

Pour cela, on considère que le biogaz est uniquement constitué de méthane et de dioxyde de carbone. Ainsi, la formule suivante est obtenue :

Biodégradabilité 100

Vmolaire = volume molaire d’un gaz parfait dans les conditions normales de pression et de température ; M(C)= masse molaire du carbone.

Equation 2 : Calcul de la biodégradabilité du carbone total des substrats.

2.2. Mise au point d’un outil d’étude des cinétiques de dégradation anaérobie

2.2.1. Description de l’outil expérimental

Les tests de potentiels méthanogènes classiques comme présentés précédemment ne permettent pas un suivi précis des cinétiques de dégradation. Outre l’imprécision en termes de dynamique liée au suivi manuel, une des principales causes est un ratio substrat/inoculum trop important. En effet, dans ces conditions, la vitesse de production de méthane observée n’est pas directement liée à la cinétique de dégradation du substrat mais à des phénomènes de croissance de biomasse qui jouent un rôle limitant très important.

Pour que le suivi de la vitesse de production de méthane en tests batch puisse être considéré comme un suivi indirect de la cinétique de dégradation du substrat, il faut appliquer des ratios substrats/inoculum environ 10 fois plus faibles que pour la détermination des potentiels méthanogènes (Yasui et al., 2009). Ainsi, pour assurer un suivi de précision et de résolution temporelle suffisante la mise au point d’un banc de 8 réacteurs batch sur lesquels la vitesse de production de biogaz est suivie en continu a été réalisée. La méthode de caractérisation des substrats associée à ces tests est appelée « respirométrie anaérobie » par analogie avec la respirométrie aérobie dont elle est inspirée (Yasui et al., 2008 & 2009).

Ces réacteurs batch ont un volume d’environ 1,5L. Ils sont munis d’agitateurs magnétiques et placés dans une étuve en conditions mésophiles. Le suivi de la vitesse de production de biogaz sur chaque réacteur et la commande des différents équipements sont assurés par un ordinateur sur lequel un programme d’automatisation sous Scilab© a été développé. La vitesse de production de biogaz est suivie par une mesure manométrique

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(Vegabar 14). Quand la surpression dans l’espace de tête des réacteurs atteint 50mbar, une électrovanne montée sur le réacteur s’ouvre. La vitesse de production de biogaz moyenne depuis la dernière ouverture de l’électrovanne est calculée à l’aide de la différence de pression mesurée et du temps écoulé depuis la dernière ouverture de l’électrovanne. Le biogaz en excès est expulsé vers une poche à gaz dont le contenu est régulièrement analysé en chromatographie en phase gazeuse. Ceci permet de déterminer la concentration en méthane du biogaz produit et d’en déduire une mesure de la vitesse de production de méthane à partir des mesures de vitesse de production de biogaz.

Figure 21 : Banc de réacteurs batch pour le suivi continu des vitesses de production de biogaz (gauche) et détail d'un réacteur (droite).

Au cours de chaque série de tests, les réacteurs sont premièrement remplis d’1L d’inoculum. Après une journée de stabilisation de la production de méthane sur chaque réacteur, les substrats étudiés sont ajoutés. Après chaque ouverture des réacteurs, l’espace de tête des réacteurs est renouvelé avec un mélange d’azote (70%) et de dioxyde de carbone (30%). Ceci permet de placer le liquide en conditions anaérobies sans trop perturber les équilibres de concentration du CO2 entre l’atmosphère gazeuse et le milieu liquide.

Afin d’assurer les besoins en inoculum qui seront constants tout au long de ce travail

Afin d’assurer les besoins en inoculum qui seront constants tout au long de ce travail

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