• Aucun résultat trouvé

Ingénierie métabolique des glycanes de la lignée cellulaire PC-3

Pour ce projet, l’ensemble des cultures de cellules PC-3 sont réalisées dans les locaux de la plateforme CIBI, en poste de sécurité microbiologique (PSM). Les étapes de marquage sont, pour des raisons pratiques, réalisées hors PSM. Bien que les protocoles de marquage utilisés ne nécessitent pas la fixation ou la perméabilisation des membranes plasmiques des cellules, leurs réalisations en condition non stérile ne permettent pas la remise en culture des cellules après marquage. Les analyses des cellules marquées ont été réalisées, avec le Dr. A. Baron, à la plateforme Imagerie-Gif (I2BC).

Le marquage métabolique des structures glycaniques modifiées des cellules PC-3 est réalisé par une stratégie de marquage en deux temps (à l’exception du composé Ac4ManNAl qui est réalisé en un temps). Après incorporation métabolique, les glycoconjugués modifiés présents à la surface des cellules sont marqués par des réactions de : SPAAC pour les dérivés fonctionnalisés par une fonction azido, IED-DA pour les composés fonctionnalisés par un groupement 1-méthylcycloprop-1-ène et CuAAC pour le dérivé fonctionnalisé par un groupement alcyne terminal. Ces réactions de couplage permettent la fixation, à la surface des cellules, d’étiquettes détectables par une macromolécule fluorescente : la biotine reconnue par une streptavidine et le 2,4-dinitrophényle reconnu par un anticorps anti-DNP (marquage en deux temps) ou directement détectable par fluorescence : la carboxyrhodamine 110 (marquage en un temps)

L’évaluation du marquage métabolique des dérivés d’hexosamine se fait quantitativement par cytométrie en flux et qualitativement par microscopie confocale. Les résultats de cytométrie sont présentés sous forme d’histogramme. Sur ces histogrammes est représentée sur l’axe des ordonnées l’intensité relative de fluorescence médiane normalisée. Pour ce projet, les sources de fluorescence utilisées sont : une streptavidine fonctionnalisée par des fluorophores Alexa®Fluor 488 (strepta-AF488) fluorescent dans le vert, une streptavidine fonctionnalisée par des fluorophores

160 S. C. Hubbard, M. Boyce, C. T. McVaugh, D. M. Peehl, C. R. Bertozzi, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2011,

21, 4945–4950.

142 FluoProbes 565A (strepta-FP565) fluorescent dans l’orange, un anticorps anti-DNP fonctionnalisé par des fluorophores AF488 (AADNP-AF488) fluorescent dans le vert et un analogue de la carboxyrhodamine 110 (N3-CR110) émettant une fluorescence dans le vert à des longueurs d’onde comparables à l’Alexa®Fluor 488. Il est à noter que les macromolécules fluorescentes sont des outils commerciaux dont les structures, le taux et l’homogénéité de fonctionnalisation en fluorophores sont inconnus.

Marquage métabolique en deux temps.

La mise au point des protocoles de marquage en deux temps a été réalisée durant les travaux de thèse du Dr. L. Fourmois. Ces protocoles ont été utilisés pour les travaux décrits dans ce manuscrit.

Le marquage en deux temps (figure 107) des cellules consiste à coupler, par un lien covalent, une étiquette détectable à la surface des cellules ayant incorporé par leurs voies métaboliques un dérivé fonctionnalisé par une fonction rapportrice. Cette étiquette détectable est ensuite reconnue par une macromolécule fluorescente qui pourra être détectée par cytométrie en flux ou par microscopie confocale.

Figure 107 : Schéma récapitulatif des étapes permettant le marquage métabolique en deux temps.

L’incorporation et le marquage métabolique des cellules PC-3 se déroulent de la manière suivante. Les cellules PC-3 sont mises en culture adhérente dans du milieu de culture RPMI 1640 complété par l’ajout de sérum de veau fœtal, de pénicilline et de streptomycine, pendant 24 h à 37°C sous atmosphère humide et 5% de CO2. Le milieu de culture est alors remplacé par du milieu contenant le ou les dérivés de monosaccharides. L’incorporation des dérivés est alors réalisée sur 24 h. Ce temps a été choisi car, lors d’expériences préliminaires, l’incorporation métabolique du Ac4ManNAz a montré de meilleurs résultats en cytométrie en flux avec 24 h d’incorporation qu’avec 48 et 72 h. Bien que le temps optimal d’incorporation puisse varier d’un dérivé à un autre ce temps sera, pour des raisons pratiques, utilisé pour chaque composé. Après 24 h d’incorporation, les cellules adhérées dans les différents puits sont lavées trois fois par une solution tampon PBS. Une

143 solution de PBS/DMSO contenant ou non l’outil nécessaire à la réaction de marquage est alors ajoutée. Les cellules sont alors placées à 26 °C sous agitation orbitalaire durant 60 min. Après marquage par une étiquette détectable, les cellules sont lavées par une solution tampon de PBS puis deux fois par une solution PBS contenant 3% (m/v) d’albumine de sérum bovin (BSA). Les lavages en présence de BSA ont pour rôle de diminuer le marquage non spécifique en occupant les sites de reconnaissance non spécifique des macromolécules fluorescentes. Les cellules sont alors mises en présence d’une solution de PBS contenant 1% (m/v) de BSA dans laquelle est ajoutée ou non la macromolécule fluorescente. Les cellules sont placées sous agitation orbitalaire et à l’abri de la lumière pendant 90 min à 26 °C. Après reconnaissance, les cellules sont lavées trois fois par une solution tampon PBS.

Pour l’analyse par cytométrie en flux, les cellules sont cultivées en plaque 6 puits. Après l’étape de reconnaissance, les cellules sont décrochées par l’ajout de trypsine (37 °C pendant 6 min) puis transférées dans des microtubes. Les cellules sont alors lavées à trois reprises par une solution tampon PBS. Les cellules sont ensuite mises en suspension dans une solution de PBS puis analysées. Pour cette méthode d’analyse, six échantillons sont systématiquement réalisés (tableau 4).

Echantillons Incorporation Marquage Reconnaissance Rôle

1 PC-3 PBS PBS/BSA

Représentatif du niveau basal de fluorescence. Les

valeurs mesurées sont normalisées par rapport à

cette expérience. 2 PC-3 PBS Macromolécule Vérification de l’absence de site de reconnaissance de la macromolécule 3 PC-3 Outil de marquage Macromolécule Représentatif du marquage non-spécifique 4 PC-3 + dérivé PBS PBS/BSA Contrôle de l’impact du dérivé sur les cellules

5 PC-3 + dérivé PBS Macromolécule Vérification de l’absence de site de reconnaissance de la macromolécule 6 PC-3 + dérivé Outil de marquage Macromolécule Représentatif du marquage spécifique

Tableau 4 : Echantillons analysés lors des expériences de marquage métabolique en deux temps.

Pour l’analyse par microscopie confocale, les cellules sont cultivées dans des puits adaptés à la microscopie. Après l’étape de reconnaissance, les cellules sont lavées à trois reprises par une solution tampon PBS. Du milieu RPMI 1640 incolore est alors ajouté puis les cellules sont analysées.

144 Pour cette méthode d’analyse, seuls les échantillons correspondants au marquage non spécifique (éch. 3) et au marquage spécifique (éch. 6) sont analysés.

Evaluation de l’incorporation métabolique des monosaccharides fonctionnalisés par marquage en deux temps.

Marquage métabolique avec une étiquette biotine et reconnaissance par la strepta-AF488.

Pour ces expériences, les outils de marquage utilisés sont les dérivés TMDIBO-PEG4-Biot ou Tz-PEG4-Biot en solution dans le tampon PBS/DMSO (99/1) et la streptavidine Strepta-AF488.

i. Incorporation métabolique du composé Ac4ManNAz.

Les cellules ont été incubées en présence de 25 µM de Ac4ManNAz 2 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 200 µM de l’outil TMDIBO-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les glycanes, fonctionnalisés par un groupement azido, présents à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situés à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Figure 108 : Analyse par cytométrie en flux de l’étude de l’incorporation de 25 µM de Ac4ManNAz pendant 24 h par la lignée cellulaire PC-3.

145 Les résultats obtenus par cytométrie en flux (figure 108) montrent que l’intensité de fluorescence augmente de façon significative dans l’échantillon 6 après incorporation du composé 2 vis-à-vis des autres échantillons. Le marquage non spécifique (éch. 3) est non significatif par rapport aux autres contrôles. L’intensité de fluorescence mesurée (éch. 6) est environ 746 fois plus élevée que pour celle des échantillons contrôles. Les résultats obtenus par cytométrie en flux semblent donc valider l’incorporation métabolique, par la lignée cellulaire PC-3, du composé 2 dans les conditions de marquage utilisées.

Afin de confirmer ces résultats et de déterminer la localisation du marquage, les cellules ont été cultivées dans des puits adaptés à l’imagerie par microscopie puis observées par microscopie confocale.

Figure 109 : Incorporation métabolique de Ac4ManNAz dans des cellules PC-3 analysée par microscopie confocale. Barre d’échelle 20 µm, puissance du laser blanc 50%, laser à 500 nm 0,5%, fenêtre de détection

520 – 560 nm.

L’observation des cellules (figure 109) confirme les résultats obtenus par cytométrie en flux. Un marquage de type membranaire est observé pour les cellules ayant subi toutes les conditions nécessaires au marquage.

Ces premières analyses confirment la capacité des cellules PC-3 à incorporer métaboliquement le composé 2.

146 ii. Incorporation métabolique du composé Ac4GalNAz.

Pour ce dérivé du GalNAc, une étude de concentration a été réalisée. Les cellules ont été incubées en présence de 25, 50 ou 75 µM de Ac4GalNAz 3 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 200 µM de l’outil TMDIBO-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les glycanes qui sont fonctionnalisés par un groupement azido et qui sont présents à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situés à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Figure 110 : Analyse par cytométrie en flux des expériences d’incorporation de 25, 50 ou 75 µM de Ac4GalNAz pendant 24 h par la lignée cellulaire PC-3.

Les résultats obtenus par cytométrie en flux (figure 110) montrent que l’intensité de fluorescence augmente de façon significative dans l’échantillon 6 après incorporation du composé 3, quelle que soit la concentration utilisée, vis-à-vis des autres échantillons. Cette augmentation est proportionnelle à l’augmentation de la concentration du monosaccharide. Le marquage non spécifique (éch. 3) est non significatif par rapport aux autres contrôles. L’intensité de fluorescence mesurée (éch. 6) est environ 476 fois plus élevée pour une concentration de 25 µM, 709 fois plus pour 50 µM et 1011 fois plus pour 75 µM. Lors de l’incubation de 75 µM de Ac4GalNAz l’intensité relative de fluorescence mesurée est 1,4 fois plus importante par rapport à celle observée à 50 µM et 2,2 fois plus importante qu’à 25 µM. Les résultats obtenus par cytométrie en flux semblent donc

147 valider l’incorporation métabolique, par la lignée cellulaire PC-3, du composé 3 dans les conditions de marquage utilisées. La concentration de 75 µM est celle retenue pour les dérivés du GalNAc dans la suite de ce manuscrit.

Afin de confirmer ces résultats obtenus par cytométrie en flux et de déterminer la localisation du marquage, les cellules ont été cultivées dans des puits adaptés à l’imagerie par microscopie puis observées par microscopie confocale. Pour cette analyse, seule l’incubation en présence de 75 µM du composé 3 a été réalisée.

Figure 111 : Incorporation métabolique de Ac4GalNAz dans des cellules PC-3 analysée par microscopie confocale. Barre d’échelle 20 m, puissance du laser blanc 50%, laser à 500 nm 1,7%, fenêtre de détection

520 – 560 nm.

L’observation des cellules (figure 111) confirme les résultats obtenus par cytométrie en flux. Un marquage de type membranaire est observé pour les cellules ayant subi toutes les conditions nécessaires au marquage.

Ces premières analyses confirment la capacité des cellules PC-3 à incorporer métaboliquement le composé 3.

148 iii. Incorporation métabolique du composé Ac4ManNCyp.

Les cellules ont été incubées en présence de 25 µM de Ac4ManNCyp 4 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 500 µM de l’outil Tz-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les structures glycaniques, fonctionnalisées par un groupement méthylcycloprop-2-èn-yl, présentes à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situés à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Figure 112 : Analyse par cytométrie en flux des expériences d’incorporation de 25 µM de Ac4ManNCyp pendant 24 h par la lignée cellulaire PC-3.

Les résultats obtenus par cytométrie en flux (figure 112) montrent que l’intensité de fluorescence augmente de façon significative dans l’échantillon 6 après incorporation du composé 4 vis-à-vis des autres échantillons. Le marquage non spécifique (éch. 3) est non significatif par rapport aux autres contrôles. L’intensité de fluorescence mesurée (éch. 6) est environ 169 fois plus élevée. Les résultats obtenus en cytométrie en flux semblent donc valider l’incorporation métabolique, par la lignée cellulaire PC-3, du composé 4 dans les conditions de marquage utilisées.

Afin de confirmer ces résultats et de déterminer la localisation du marquage, les cellules ont été cultivées dans des puits adaptés à l’imagerie par microscopie puis observées par microscopie confocale.

149

Figure 113 : Incorporation métabolique de Ac4ManNCyp dans des cellules PC-3 analysée par microscopie confocale. Barre d’échelle 20 m, puissance du laser blanc 50%, laser à 500 nm 4%, fenêtre de détection

520 – 560 nm.

Les images ci-dessus confirme les résultats obtenus par cytométrie en flux. Un marquage de type membranaire est observé pour les cellules ayant subi toutes les conditions nécessaires au marquage.

Ces premières analyses confirment la capacité des cellules PC-3 à incorporer métaboliquement le composé 4.

150 iv. Incorporation métabolique du composé Ac4ManNCCyp.

Les cellules ont été incubées en présence de 25 µM de Ac4ManNCCyp 6 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 500 µM de l’outil Tz-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les structures glycaniques, fonctionnalisées par un groupement méthylcycloprop-2-èn-yl, situées à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situés à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Figure 114 : Analyse par cytométrie en flux des expériences d’incorporation de 25 µM de Ac4ManNCCyp pendant 24 h par la lignée cellulaire PC-3.

Les résultats obtenus par cytométrie en flux (figure 114) montrent que l’intensité de fluorescence augmente de façon significative dans l’échantillon 6 après incorporation du composé 6 vis-à-vis des autres échantillons. Le marquage non spécifique (éch. 3) est non significatif par rapport aux autres contrôles. L’intensité de fluorescence mesurée (éch. 6) est environ 472 fois plus élevée. Les résultats obtenus par cytométrie en flux semblent donc valider l’incorporation métabolique, par les cellules PC-3, du composé 6 dans les conditions de marquage utilisées.

Afin de confirmer ces résultats et de déterminer la localisation du marquage, les cellules ont été cultivées dans des puits adaptés à l’imagerie par microscopie puis observées par microscopie confocale.

151

Figure 115 : Incorporation métabolique de Ac4ManNCCyp dans des cellules PC-3 analysée par microscopie confocale. Barre d’échelle 20 m, puissance du laser blanc 70%, laser à 500 nm 1%, fenêtre de détection

520 – 540 nm.

L’observation des cellules (figure 115) confirme les résultats obtenus par cytométrie en flux. Un marquage de type membranaire est observé pour les cellules ayant subi toutes les conditions nécessaires au marquage.

Ces premières analyses confirment la capacité des cellules PC-3 à incorporer métaboliquement le composé 6.

152 v. Incorporation métabolique du composé Ac4GalNCyp.

Les cellules ont été incubées en présence de 75 µM de Ac4GalNCyp 5 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 500 µM de l’outil Tz-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les structures glycaniques, fonctionnalisées par un groupement méthylcycloprop-2-èn-yl, présentes à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situés situées à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Figure 116 : Analyse par cytométrie en flux des expériences d’incorporation de 75 µM de Ac4GalNCyp pendant 24 h par la lignée cellulaire PC-3.

Aucune augmentation significative de l’intensité de fluorescence de l’échantillon 6 n’est observée (figure 116) après incubation en présence du composé 5 vis-à-vis des autres échantillons. Il semble donc qu’aucun marquage ne soit présent, au niveau des glycoconjugués extracellulaires de cellules PC-3, après incubation avec le composé 5.

153 vi. Incorporation métabolique du composé Ac4GalNCCyp.

Les cellules ont été incubées en présence de 75 µM de Ac4GalNCCyp 7 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 500 µM de l’outil Tz-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les structures glycaniques, fonctionnalisées par un groupement méthylcycloprop-2-èn-yl, présents à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situées à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Figure 117 : Analyse par cytométrie en flux des expériences d’incorporation de 75 µM de Ac4GalNCCyp pendant 24 h par la lignée cellulaire PC-3.

Aucune augmentation significative de l’intensité de fluorescence de l’échantillon 6 n’est observée (figure 117) après incubation en présence du composé 7 vis-à-vis des autres échantillons. Il semble donc qu’aucun marquage ne soit obtenu, au niveau des glycoconjugués extracellulaires de cellules PC-3, après incubation avec le composé 7.

154 vii. Incorporation métabolique du composé non peracétylé : ManNAz. Les cellules ont été incubées en présence de 500 µM de ManNAz 1 pendant 24 h. Après incubation, une solution de PBS/DMSO (99:1) contenant 200 µM de l’outil TMDIBO-PEG4-Biot a été ajoutée afin de marquer les structures glycaniques, fonctionnalisées par un groupement azido, présentes à la surface des cellules. Après 60 min de marquage, les motifs biotine situés à la surface des cellules ont été détectés lors de l’étape de reconnaissance en présence d’une solution contenant 10 µg/ml de strepta-AF488 pendant 90 min.

Suite à des difficultés techniques, seule l’analyse par microscopie confocale est présentée dans ce manuscrit (figure 118).

Figure 118 : Incorporation métabolique de ManNAz dans des cellules PC-3 analysée par microscopie confocale. Barre d’échelle 20 m, puissance du laser blanc 70%, laser à 500 nm 1%, fenêtre de détection

520 – 540 nm.

Un marquage spécifique, de type membranaire, est observé pour les cellules ayant subi toutes les conditions nécessaires au marquage.

Ces premières analyses confirment la capacité des cellules PC-3 à incorporer métaboliquement le composé 1.

155 viii. Discussion sur l’incorporation métabolique des dérivés par

marquage en deux temps avec une étiquette biotine.

 Analyses par cytométrie en flux : dérivés fonctionnalisés par un groupement azido.

Figure 119 : Analyse par cytométrie en flux pour de l’incorporation des dérivés fonctionnalisés par un groupement azido, par la lignée cellulaire PC-3, lors d’un marquage avec l’outil TMDIBO-PEG4-Biot et la

Strepta-AF488.

Les résultats présentés dans la figure 119 montrent que l’intensité de fluorescence est 1,6 fois plus importante en présence de 25 µM de Ac4ManNAz par rapport à 25 µM de Ac4GalNAz. Lorsque la concentration du Ac4GalNAz augmente à 50 µM, l’intensité de fluorescence devient comparable à celle du Ac4ManNAz à une concentration de 25 µM. A 75 µM de Ac4GalNAz, l’intensité de fluorescence devient 1,4 fois plus importante que celle du Ac4ManNAz à une concentration de 25 µM.

Ces résultats sont à modérer par le fait que les cellules ayant été incubées en présence du dérivé du ManNAc n’ont pas été cultivées et analysées le même jour que les cellules ayant poussé en présence du dérivé du GalNAc. En effet, le comportement des cellules peut varier d’une semaine à une autre pour diverses raisons (notamment le nombre de repiquage des cellules) et les valeurs numériques mesurées par cytométrie en flux sont, quant à elles, impactées par des phénomènes de bruit électronique qui peuvent varier d’une utilisation à une autre. Cependant, pour les cellules

156 ayant été cultivées et marquées dans des conditions comparables, il est possible de définir une tendance dans leurs comportements vis-à-vis de l’expérience. Pour obtenir une intensité de fluorescence comparable, la concentration du dérivé du Ac4GalNAz doit être supérieure à celle du dérivé Ac4ManNAz (deux fois plus dans notre exemple). La plus faible intensité de fluorescence mesurée pour le dérivé Ac4GalNAz peut être liée à divers phénomènes tels que : des voies métaboliques moins tolérantes vis-à-vis des analogues du GalNAc par rapport à celles du ManNAc, le nombre de sites portant un résidu GalNAc, au niveau des structures glycaniques (la sialylation est généralement supérieure à la GalNacylation) ou encore une gêne stérique, au niveau des glycoconjugués, plus importante pour le dérivé du GalNAc que pour celui du Neu5Ac (le Neu5Ac est présent exclusivement en extrémité des chaînes des structures glycaniques. Le GalNAc quant à lui est, généralement, présent uniquement au début ou au milieu des chaînes de O-glycanes et des