Impact du stress sur la production de la protéine Hsp12

1 Introduction

La protéine Hsp12 a fait l’objet de plusieurs études afin d’identifier les stress responsables de son expression. La plupart des études se sont basées sur la quantification des transcrits du gène HSP12 (Praekelt and Meacock, 1990; Martínez-Pastor et al., 1996; Ivorra, Pérez-Ortín and Del Olmo, 1999; Amorós and Estruch, 2001; Carrasco et al., 2001). Toutefois, la corrélation entre la quantité des transcrits du gène HSP12 et la quantité de protéine Hsp12 traduite n’a pas été montrée. En effet, chez la levure la quantité de protéine est corrélée à la quantité d’ARNm pour seulement un tiers des protéines (Schwanhüusser et

al., 2011). Il est donc nécessaire de quantifier la protéine Hsp12 pour évaluer l’impact des

stress sur la production de la protéine Hsp12. Le dosage ELISA développé au cours de la thèse permet de répondre à cet objectif. L’impact de trois stress sur la quantité de protéine Hsp12 est ainsi évalué : le stress thermique, le stress osmotique et le stress éthanolique.

Afin d’étudier l’impact de ces stress, des cultures de la levure Saccharomyces

cerevisiae sont réalisées. La levure développe 2 métabolismes particuliers selon les

conditions environnementales : un métabolisme respiratoire en condition aérobie et un métabolisme fermentaire en condition anaérobie. Elle peut également développer un métabolisme respiro-fermentaire, qui correspond à la combinaison des 2 métabolismes, en condition aérobie et en présence d’une concentration de glucose supérieure à 150 mg/L. Dans les 3 cas, la levure consomme le glucose présent dans le milieu et le transforme en pyruvate grâce à la glycolyse. Dans le cas du métabolisme respiratoire, le pyruvate est ensuite transformé en différents intermédiaires intervenant dans le cycle de Krebs menant à la consommation de dioxygène et à la production d’eau, de dioxyde de carbone et d’une grande quantité d’ATP (36 moles pour 1 mole de glucose) (Figure 17). Dans le cas d’un métabolisme fermentaire, le pyruvate est transformé en éthanol et permet la production de CO2 et d’une petite quantité d’ATP (2 moles pour 1 mole de glucose) grâce à la glycolyse. De plus, des métabolites secondaires comme le glycérol et des acides organiques (acides

80 succinique et acétique principalement) sont également formés en faible quantité. Le glycérol, co-produit majoritaire après l’éthanol et le CO2, est lui issu d’une déviation de la voie de la glycolyse (Figure 17).

Figure 17 : Schéma simplifié représentant les métabolismes respiratoire et fermentaire chez Saccharomyces cerevisiae.

En milieu YPD et en condition aérobie, la levure S. cerevisiae va développer un métabolisme respiro-fermentaire avec une composante fermentaire majoritaire. Ceci est appelé l’effet Crabtree, qui se caractérise par l’utilisation préférentielle d’un métabolisme fermentaire en présence d’oxygène, lorsque la concentration en glucose est supérieure à 150 mg/L (Otterstedt et al., 2004; Pfeiffer and Morley, 2014). La levure va ainsi transformer essentiellement le pyruvate en éthanol et en CO2. Une partie du pyruvate intégrera toutefois un métabolisme respiratoire menant à la production d’ATP, permettant ainsi une croissance rapide des levures. Les levures vont donc consommer du glucose et de l’O2 et produire de l’éthanol ainsi que du CO2. Elles vont également produire des métabolites secondaires (glycérol, acides organiques). Ces conditions sont optimales pour la croissance des levures, elles vont donc se multiplier de façon exponentielle jusqu’à l’épuisement du glucose. Une fois la totalité du glucose consommée, les levures entrent dans une phase de changement métabolique appelée la transition diauxique (Uzawa et al., 2004; Chu and Barnes, 2016). Elles passent ainsi d’un métabolisme respiro-fermentaire à un métabolisme respiratoire.

81 Cette transition se traduit par, d’une part le ralentissement de la croissance et de la production de CO2 et, d’autre part l’utilisation de l’éthanol et des métabolites secondaires comme substrat. Puis, les levures vont entrer dans une deuxième phase de croissance exponentielle, caractérisée par un taux de croissance plus faible que lors de la consommation du glucose. Lorsque la totalité de l’éthanol et des métabolites secondaires sont consommés, les levures entrent alors en phase stationnaire, caractérisée par un taux de croissance nul.

La concentration cellulaire, la concentration en substrats et en métabolites, la consommation de l’O2, le dégagement de CO2 et le pH permettront de suivre les cultures de

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2 Evaluation de l’impact des stress

L’impact de 3 stress (thermique, osmotique et éthanolique) appliqués pendant 1h est évalué grâce à des cultures de la souche Fx10 réalisées en Erlenmeyer. Pour l’évaluation de chaque stress, 10 cultures sont menées en parallèle dont 5 cultures témoins et 5 cultures stressées. Le stress est appliqué au moment de la transition diauxique pour plusieurs raisons :

i. s’affranchir de la répression de l’expression du gène HSP12 lorsque la levure consomme le glucose (De Groot et al., 2000).

ii. standardiser le moment ou est appliqué le stress et assurer la reproductibilité des résultats entre chaque culture.

Le stress est appliqué pendant 1h. Puis les cellules sont récoltées afin d’extraire la protéine Hsp12 par sonication et chauffage. La quantification de la protéine Hsp12 par dosage ELISA est réalisée à partir de 3 dilutions de chaque échantillon. Ainsi, 15 valeurs de concentration sont obtenues pour chaque condition expérimentale (témoin et stressée). Pour chaque échantillon, le quotient de sa concentration en protéine Hsp12 par rapport à la moyenne des concentrations des échantillons témoins est calculé.

𝑄𝑢𝑜𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡 = ^{[𝐻𝑠𝑝12]} 𝑚̅ [𝐻𝑠𝑝12]𝑡é𝑚𝑜𝑖𝑛

Ce calcul permet de comparer les facteurs d’augmentation ou de diminution de la quantité de protéine Hsp12. Après vérification de la normalité des valeurs et de l’homogénéité de leur variance, des tests statistiques de comparaison de moyenne permettent d’analyser l’impact de chaque stress sur la quantité de protéine Hsp12 produite.

2.1 Suivi de croissance des levures

Le suivi des cultures est réalisé par la mesure de la densité optique (DO) à 600 nm représentant la biomasse, et, par le dosage du glucose dans le milieu. A titre d’exemple, le suivi d’une culture témoin et d’une culture stressée lors de l’évaluation du stress thermique

83 est montré ci-dessous (Figure 18). Des résultats similaires sont obtenus avec les stress osmotique et éthanolique.

Figure 18 : Suivi des cultures témoin et stressée lors de l’évaluation du stress thermique. Pour les courbes ln(DO), les barres d’erreur correspondent aux déviations standards de la mesure

de chaque valeur en triplicata.

Après adaptation des levures aux conditions de culture, la croissance se fait de manière exponentielle à partir de 2h de culture avec un taux de croissance maximal de 0,51 h^-1. A partir de 8h de culture, un ralentissement de la croissance des levures est observé. Ce ralentissement est concomitant de l’épuisement du glucose dans le milieu, substrat carboné principal. A 9h de culture, la transition diauxique intervient. Les stress sont alors appliqués : augmentation ou diminution de la température, augmentation de l’osmolarité ou ajout d’éthanol. A 10h de culture, la quantité de biomasse est stable dans les cultures témoins et dans les cultures stressées. Par conséquent, les stress étudiés ne semblent pas avoir d’effet notable sur la croissance des levures, mais quel est leur impact sur la quantité de protéine Hsp12 ?

2.2 Stress thermiques

Les cultures témoins sont menées à 30°C. L’impact de deux stress thermiques a été évalué, d’une part, l’augmentation de la température à 40°C et d’autre part, la diminution à 20°C.

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