L’hybridation in situ est un marquage d’ARNm. À l’origine l’hybridation est développée pour marquer
des ADN fixés sur une membrane à l’aide d’une sonde ARN (Gillespie & Spiegelman, 1965). Puis la
technique est utilisée sur des coupes de tissus (Orth et al., 1971). Les sondes sont alors couplées à un
élément radioactif pour permettre une révélation par autoradiographie. Cette technique de marquage « chaud » est contraignante d’abord parce qu’il faut manipuler de la radioactivité et ensuite parce que l’étape de révélation est très longue. Le marquage « froid » est développé au
Figure 46 : Immunohistochimie
A : Marquage sans amplification. L’anticorps primaire reconnait l’antigène d’intérêt puis est
lui-même reconnu par un anticorps secondaire couplé à une enzyme qui, en présence de son substrat
(Diaminobenzidine , DAB), forme un précipité brun. B : Marquage avec amplification. L’anticorps
primaire reconnait l’antigène d’intérêt puis est lui-même reconnu par un anticorps secondaire couplé à de la biotine. Il faut ensuite ajouter de l’avidine (à forte affinité pour la biotine) couplée à une enzyme qui, en présence de son substrat, DAB forme un précipité brun.
Gène Séquences amorces (5'-3') Position et n° accession Taille amplicon Actba F : TGCAGGCTAGGCAGTCTGAA 1040-1483 de NM_37482 443 R : TCCATTTGCTCTGGGACCTG Amh F : ACCCCTTCCTAGAGACCCTCA 5388-6049de NM_012902.1 725 R : CACCACGTGGTTCCCGTAGC Cyp19a1 F : TGGATGGGGATTGGAAGTGCCTG 797-1487 de NM_33936 691 R : CACGTTCTCCTTTGTCAGGTCTCC Dpp6 F : TACTGTGCCCATGTTGGAAA 549-1285 de NM_ 022850 736 R: GGCAGGTCCTCTGTGCTTAG Ednrb F : CTGTGGGGATCACAGTGTTG 551-1211 de NM_ 017333 661 R : CAGCAGCACAAACACGACTT Gdf9 F : GGCATTTCCCAGCAGATTCCTG 3-546 de NM_021672 544 R : CTCCTTTACCACAAGGTCACAC H3f3b F : TACCCTTCCAGAGGTTGGTG 194-973 de NM_053985 779 R : CAAGACTCCCCACCACTTGT Inha F : ATGGTGATCCAGCCGTCTCT 256–765 de NM_012590.1 510 R : CAAGGACACAGGCACAGCCAT Isyna1 F : ATTGGCTCTGGCCTCAAGAC 1060-1667 de NM_001013880 608 R : GCCTTCACCTCTTCTGGCTT Nobox F : ATGTTCCTGGCAGTGACAGCA 908-1255 de NM_ 001192013 348 R : TTGGCTGCAGCAAGATCTGAC Psmb9 F : CATCATGGCTGTGGAATTTG 66-583 de NM_012708 518 R : GGTAGATGACACCCCCACTG Anticorps primaire
Anticorps secondaire couplé à la
peroxydase
DAB réduite
(incolore) DAB oxydée
(coloration brune) Tissu DAB réduite DAB réduite DAB réduite DAB oxydée DAB oxydée DAB oxydée Tissu A B
Antigènes Anticorps secondaire couplé à la biotine
Avidinecouplée à des
milieu des années 70 et utilise des sondes couplées à la biotine (Manning et al., 1975) mais la révélation utilise le même système enzymatique qu’en immunohistochimie et l’activité peroxydase endogène des tissus génère un important bruit de fond. La biotine est alors remplacée par de la
digoxygénine permettant une révélation à l’aide d’une phosphatase alcaline (Herrington et al., 1989).
La plupart des sondes utilisées ont été synthétisées pour cette étude (liste en tableau 18). D’autres sondes étaient déjà présentes au laboratoire : Msy2 (marqueur ovocytaire, non présenté dans la
liste, les séquences de ses amorces figurent dans l’article « Systemic compensatory response to
neonatal estradiol exposure does not prevent depletion of the oocyte pool in the rat ») et Inha
(marqueur des cellules de la granulosa Guigon et al., 2003a).
i. Synthèse de ribosondes
Des amorces de PCR correspondant à un gène d’intérêt (marqueur des cellules germinales, marqueurs de croissance…) sont dessinées grâce au logiciel libre (Primer3) en fonction de la séquence du gène présente dans les bases de données (NCBI gene). Après un alignement de séquences multi-espèces, les amorces sont choisies dans des zones conservées par l’évolution. La taille de l’amplicon doit être grande (généralement entre 500 et 900 bases) car plus l’amplicon généré est long, plus la sonde qui en découlera portera de molécules de digoxygénine nécessaires au marquage et ceci facilitera sa détection en amplifiant la réaction de révélation. Les séquences des amorces «forward» et «reverse» doivent avoir une quantité de bases AT et GC similaire afin que leurs températures optimales d'hybridation soient compatibles. Les amorces sont testées en PCR (figure 47, page suivante) sur des ADNc issus d’animaux chez lesquels le gène correspondant est exprimé. Le produit de PCR est ensuite séquencé (MWG Operon). Puis il est purifié (à l’aide de Kits QIAGEN selon les instructions du fournisseur) et intégré à l’aide d’une ligase dans un plasmide pGEM-T easy (Promega). Le plasmide porte un gène de résistance à l’ampicilline, un site multiple de clonage (site reconnu par de nombreuses enzymes de restriction) et est ouvert sur le site de son gène Lac Z, avec des extrémités Thymine disponibles permettant l’insertion du produit de PCR d’intérêt qui porte à son extrémité une base Adénine. Ce plasmide est ensuite introduit par transformation dans des bactéries compétentes XL 1blue (Invitrogen) grâce à un choc thermique. Puis les bactéries sont mises en culture dans du milieu SOC (Invitrogen) à 37°C dans un incubateur-agitateur (1 heure, 180 rpm (New Brunswick)). La pré-pousse obtenue est mise en culture sur gélose (25g/L LB -Luria Broth, Sigma- ; eau ; 15 g/L agar -Eurobio) contenant 40 µl de X-Gal [20 mg/ml] et 40 µl d’IPTG [20 mg/ml] (Promega), à 37°C pendant une nuit.
Les clones d’intérêt obtenus sont reconnaissables à leur couleur blanche parce que l’insert interrompt le gène Lac Z responsable de la métabolisation du X-gal produisant la couleur bleue. Ils sont prélevés et remis en culture dans du milieu LB contenant de l’ampicilline [100 µg/ml] pour s’assurer que les bactéries ne perdent pas leur plasmide en cours de culture, une nuit à 37°C avec agitation. Une petite quantité de la pousse est soumise à une MINIprep (kit QIAGEN, selon les instructions du fournisseur) : le kit sert à extraire le plasmide, qui est ensuite digéré par des enzymes de restriction possédant un site de coupure dans le site multiple de clonage du plasmide (ou à une extrémité de l’insert) afin d’en vérifier la taille par électrophorèse. La totalité de la pousse
Pré-pousse
Étalement sur gélose X-gal / IPTG Transformation en bactéries compétentes (XL1 blue) Amplification spécifique Ajout d’une base A
Ligation dans le plasmide (p-GEMt-easy)
Sélection de clones blancs
Amplification en bactéries en milieu sélectif
(Ampicilline)
MINIPrep : Kit Qiagen Extraction plasmidique Contrôle de l’insert Remise en culture
MIDIPrep : Kit Qiagen Extraction des plasmides Extraction & précipitation ADN
(phénol/chloroforme) Synthèse des sondes par complémentarité à l’aide de nucléotides marqués à la digoxygénine
5’ 5’ 5’ A Promoteur T7 Promoteur Sp6 T T Gène Lac Z Site multiple de clonage
Linéarisation du plasmide :
Digestion par Sac II : insert sous dépendance du promoteur Sp6 Digestion par Nde I : insert sous dépendance du promoteur T7
Figure 47 : Synthèse ribosondes pour HIS
Grâce à la complémentarité A/T, les produits de PCR peuvent s’intégrer dans un plasmide à bout T sortant, lui-même introduit dans une bactérie compétente. Si ces étapes fonctionnent, les bactéries hôtes deviennent incapables de métaboliser le X-gal mais sont résistantes à l’ampicilline. Les plasmides sont ensuite extraits et linéarisés puis purifiés avant de servir de matrice pour la synthèse
bactérienne est alors soumise à une MIDIprep (kit QIAGEN, selon les instructions du fournisseur) pour extraire et purifier le plasmide en grande quantité (et éliminer notamment l’ADN chromosomique bactérien). La quantité d’ADN est dosée par spectrophotométrie à 260 nm (Nanodrop). Le plasmide purifié subit une nouvelle électrophorèse de contrôle avant d’être linéarisé : il est digéré par une enzyme de restriction possédant un site unique de coupure dans le site multiple de clonage (pas dans l’insert). L’ADN est ensuite purifié et précipité : un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique est ajouté au produit de MIDIprep digéré. Après avoir été vortexé et centrifugé à vitesse maximale, la phase aqueuse supérieure est récupérée, additionnée de 100 µl de chloroforme/alcool isoamylique pour retirer les traces de phénol, vortexée, centrifugée. La phase aqueuse supérieure est à nouveau récupérée, additionnée d’acétate de sodium (3M pH5.2) et de trois volumes d’éthanol 100% pour précipiter l’ADN. Après une nuit à -20°C, le mélange est centrifugé -toujours à vitesse maximale- 30 min à 4°C. Le culot obtenu est lavé à l’éthanol 70%, repris dans de l’eau [500 ng/µl] et conservé à -20°C.
Les sondes ARN sens (témoin négatif) et antisens (sonde test) sont synthétisées par transcription in
vitro à partir du plasmide linéarisé en présence d’ARN polymérases SP6 ou T7 et de nucléotides marqués à la digoxygénine pendant 2h à 37°C (Roche). L’ADN matrice est digéré par la DNAse I (Roche) 30 min, à 37°C. Les sondes ARN sont précipitées à l’aide de chlorure de lithium et deux volumes d’éthanol 100%. Après une nuit à -20°C, le mélange est centrifugé à vitesse maximale 30 min à 4°C. Le culot obtenu est lavé à l’éthanol 70%, repris dans de l’eau et conservé à -20°C.
ii. Hybridation in situ
La verrerie utilisée en hybridation ne doit pas être contaminée par des RNAses. Pour s’en assurer, elle est chauffée au préalable 1h30 à 180°C au four. Les tampons et solutions sont préparés avec de l’eau DEPC. La composition des différents tampons et solutions est détaillée dans le tableau 19, page suivante.
Les lames portant les coupes de tissu à hybrider sont décongelées à 42°C sur une platine chauffante, puis plongées dans un bain de chloroforme (30 secondes, pour éliminer les lipides des tissus), trois bains de PBS 1X pH 7.3 (3 x 5 min, pour les réhydrater), deux bains de TEA (Triéthanolamine 18.5 g/L, 2 x 5 min). Dans chaque bain de TEA, on ajoute goutte à goutte 250 µl d’anhydride acétique sous agitation. Celui-ci bloque les groupements amines réactifs du tissu afin d’empêcher les hybridations aspécifiques. Ensuite les lames sont plongées dans deux bains successifs de 2X SSC (2 x 5 min). Les coupes sont couvertes d’une goutte de tampon de pré-hybridation, pendant 2 heures à 55°C, dans une cuve noire à saturation de vapeurs de formamide afin d’abaisser la température d’hybridation optimale pour qu’elle soit compatible avec la conservation des tissus.
Les sondes d’hybridation sont ensuite diluées dans le tampon d’hybridation, dont la constitution est semblable à celle du tampon de pré-hybridation, à l’exception de l’EDTA et de l’ADN de sperme de saumon (tableau 19). Le facteur de dilution des sondes dépend de leur qualité, de l’abondance de leur cible dans le tissu et de leur conformation afin d’assurer lors de la révélation un signal optimal. Il
Solution Composition
TEA 3.7g triéthanolamine poudre
200ml H2O DEPC
pH 8
20X SSC 87.66g NaCl
44.11g Na3citrate 2H2O (trisodium dihydraté)
H2O DEPC qsp 500ml
pH 7
Tampon de pré-hybridation 1 ml Formamide désionisé (Sigma)
200µl 20X SSC
100µl Denhardt’s solution stock 100X 5µl Yeast tRNA (solution Sigma, 20mg/ml)
40µl EDTA 200mM pH 8
100µl Dextran stock 50% (saturation des sites aspécifiques, Sigma)
360µl H2O pure (Eurobio)
200µl d’ADN de sperme de saumon à 2.5mg/ml
Tampon de saturation 25% 20X SSC 25% H2O 50% formamide Denhardt 100 X 1g Ficoll400 1g polyvinylpyrolidone 1g BSA 50 ml H2O NTE NaCl 500mM Tris 10mM EDTA 5mM pH 7.5 0.1X SSC-30% formamide 69.5 ml H2O 30 ml formamide 500µl 20X SSC T1 100 ml Tris 1M 30ml NaCl 5M H2O qsp 1L pH 7.5 T2 57 ml T1
3 ml agent bloquant 10% (Boehringer 1096176)
T3 100 ml Tris 1M
20 ml NaCl 5M
est déterminé de façon empirique dans des expériences pilotes. Il est en général de 100, sauf dans le cas de Msy2 (400). Les sondes diluées sont placées 3 minutes à 65°C afin de les dénaturer, puis immédiatement sur glace afin d’éviter les ré-appariements et enfin déposées sur les coupes et laissées une nuit à 55°C dans une cuve à saturation de vapeurs de formamide.
Le lendemain, les lames sont rincées (2 x 5 min) dans du 2X SSC puis traitées à la RNAse A qui dégrade les ARN simple brin (3 ml de tampon NTE +12µl de RNASes à 20µg/ml, 30 min, 37°C). Les lames sont rincées dans du 2X SSC (3 x 5min) puis dans du 0.1X SSC-30% formamide préchauffé au bain marie à 60°C (en conditions stringentes, 1 heure), puis dans un bain de 5 minutes de tampon T1 avant un bain de 2 heures à température ambiante dans du tampon T2 (contenant un agent bloquant). Ensuite les coupes sont recouvertes d’une solution d’anticorps anti-digoxygénine couplés à une phosphatase alcaline (anticorps anti-DIG Roche dilué au 1/500 dans T2, 2 heures à 37°C). Cette incubation est suivie de trois bains successifs de 5 min dans du tampon T1 (0.15 M NaCl, 0.1 M Tris,
pH 7) et deux bains de 10 min dans du tampon T3 complet (T3 MgCl2 50mM extemporanément). Le
tampon T3 est plus alcalin que le T1 pour permettre l’action de la phosphatase alcaline. Enfin, la solution de révélation est déposée sur les coupes. Le levamisole qu’elle contient inhibe les phosphatases alcalines endogènes, tandis que le BCIP et le NBT sont des substrats de la phosphatase alcaline. La solution de révélation reste sur les coupes une nuit à température ambiante à l’obscurité. Les lames sont ensuite rincées dans du PBS 1X et peuvent être montées dans un milieu Glycérol Gélatine. Si une immunofluorescence ou un TUNEL est envisagé, les lames sont séchées et conservées à 4°C (maximum une semaine) si elles ne sont pas traitées immédiatement.