Les graphes et les alignements sont placés dans le dossier-papier du patient ;

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5) Les variations identifiées issues de la comparaison aux séquences de référence utilisées sont classées selon le type de chaque mutation entre polymorphismes, mutations pathogènes ou encore des variations de signification inconnue.

1.2.7 Bioinformatique

Les numéros d'accès aux bases de données internationales pour les séquences de référence sont énumérés comme suit (gène, transcrit, protéine) :

MLH1 (AC011816.17, NM_000249.2, NP_000240.1), MSH2 (AC079775.6, NM_000251.1, NP_000242.1) et MSH6 (AC006509.15, NM_000179.1, NP_000170.1).

Les changements d'acides aminés ont été déduits à partir des modifications de nucléotides par rapport à une séquence de référence de la protéine de base de données : UniProt, en utilisant ID: P40692 pour MLH1 et ID: P43246 pour MSH2.

1.2.8 Ressources Web et Software utilisés pour études fonctionnelles in Silico Tout variant de séquences d'ADN identifié a été confirmé par séquençage des deux brins d'ADN sur au moins deux produits de PCR indépendants. Les mutations retrouvées sont étudiées sur sites Web et logiciels spécifiques conformément aux bases de données interna-tionales des mutations dans les gènes MMR tels que: The International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours (InSiGHT) https://www.insight-group.org/, Colon cancer gene variant databases (LOVD Leiden open variation database) (http://chromium.lovd.nl/LOVD2/colon_cancer/home) (Peltomäki and Vasen, 2004) et Universal Mutation Database (UMD® software) (Grandval et al., 2013) :

Les nomenclatures des mutations sont décrites en conformité aux dernières recommandations de nomenclatures des mutations sur le site (www.hgvs.org/mutnomen) et vérifiés à l'aide du programme Mutalyzer (http://www.LOVD.nl/mutalyzer/).

Des études fonctionnelles In Silico ont été menées pour certaines variations non répertoriées dans les bases de données citées ci-dessus. Les analyses de mésappariements faux sens sont réalisées afin de prédire les altérations sur la fonction des protéines par des outils informa-tiques tels que le SIFT, Polyphen2 (Adzhubei et al., 2010) et MAPP-MMR (Stone et Sidow, 2005)(Chao et al., 2008). Les Seuils <0.05 [SIFT], >2.0 [PolyPhen2] et >4.55 [MAPP-MMR] sont utilisés pour classer les variants délétères :

 Le logiciel SIFT (Sort Intolerant From Tolerant) (http://sift.jcvi.org/) utilise l’homologie de séquence entre les domaines et les gènes de la même famille pour déterminer le degré de conservation d’un résidu d’acide aminé, ainsi que les propriétés physiques des acides aminés pour prédire la pathogénicité d’un variant.

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 PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) est un outil qui, en plus de la conservation des séquences, utilise l’information de la structure protéique et de la structure tridimensionnelle, lorsqu’elle est disponible, pour prédire les effets sur la structure secondaire et les sites fonctionnels de la protéine.

 MAPP-MMR (Multivariate Analysis of Protein Polymorphisms–Mismatch Repair) (http://mappmmr.blueankh.com/): quantifie la variation physico-chimique dans chaque colonne d'un alignement de séquences multiples et calcule l'écart des remplacements d'acides aminés candidats par rapport à cette variation (Stone et Sidow, 2005).

Les mutations dans les jonctions d'épissage GT-AG étaient considérés évidemment pathogènes (Houdayer et al., 2008). Les mutations introniques situées en dehors de la jonction d'épissage ont été analysées par trois logiciels différents, NNSPLICE version 0.9, Net-Gene2 et Human Splicing Finder (HFS) version 3.0 à l'aide des seuils de défaut qui leurs sont appropriés :

 NNSPLICE version 0.9 (Neural Network splice site predictor) (http://www.fruitfly.org/ seq_tools/ splice.html)il sert à analyser la structure des sites donneurs et accepteurs d'épissage en utilisant un algorithme distinct qui reconnait de façon optimale chaque site.

 Net-Gene2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2)est appliqué pour la prédiction de l'emplacement du site d'épissage dans le pré-ARNm humain. Ce schéma de prédiction correspondant aux régions de transition entre les introns et les exons détecte les niveaux de coupure attribués aux sites d'épissage potentiellement présents sur une séquence.

 Human Splicing Finder (HFS) version 3.0 (http://www.umd.be/HSF3 /index.html) est un outil destiné à l'étude de l'épissage de pré-ARNm, il utilise des algorithmes développés pour calculer les valeurs consensus des sites d'épissage potentiels et rechercher des points de branchements pour une séquence donnée.

La validation des résultats pour chaque test doit être effectuée avec au moins deux logiciels différents.

1.2.9 Statistique

Certains de nos résultats sont traités par des statistiques descriptives : calcul de la moyenne arithmétique, de l’écart type et les pourcentages.

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1.2.10 Analyse des réarrangements par Multiplex Ligation dependent Probe Amplification (MLPA):

A la suite des résultats observés sur nos séquences, en cas d’absence de mutations ponctuelles, nous procédons à l’analyse par MLPA pour mettre en évidence d’éventuels réarrangements sur MLH1, MSH2, MSH6 et EpCAM. Cette technique permet la détection de remaniements génomiques de grande taille. La MLPA est utilisée pour la recherche de perte et/ou de duplication exonique (non visible lors du séquençage).

Principe : Il est basé sur une réaction de ligation de 2 oligonucléotides adjacents, formant une sonde après leur hybridation à des séquences cibles spécifiques, ce qui permet d’obtenir pour chaque locus un fragment amplifié de taille différente et de les quantifier par électrophorèse sur un séquenceur CEQ 8800. Chaque fragment peut alors être visualisé sous forme d’un pic qui selon son amplitude par rapport au témoin, permet la détection du nombre de copies en moins ou en plus, au niveau de ce locus (Fig. 33).

La MLPA comporte 4 étapes : 1. Hybridation

Après dénaturation, l’ADN des patients est mis en contact avec un Mix de sondes (amorces de ligation) pour une hybridation passive pendant 16 heures.

2. Ligation

La ligation ne se réalisera que si les 2 « amorces de ligation » se sont hybridées de façon spécifique et conjointe. La ligase raccordera donc la partie 3’ à la partie 5’phosphorylée.

3. PCR

Après inactivation de la ligase par chauffage, on réalise une amplification des produits de ligation. L’amorce antisens est marquée en 5’ par un fluorophore .

Durant le premier cycle de PCR, seul l’amorce Reverse s’hybride. Au moment du second cycle la deuxième amorce s’hybride également.