Les fractionnements chimiques

Le protocole IHSS, de fractionnement de la matière organique des sols, est recommandé par la Société Internationale des Substances Humiques (IHSS) (Calderoni et Schnitzer, 1984). Il est basé sur des critères de solubilité. Les lipides sont solubilisés dans les solvants organiques. Les acides "fulviques" et "humiques" sont extraits en milieu alcalin. Les "acides humiques" sont séparés des "acides fulviques" par précipitation en milieu acide. "L’humine" reste totalement insoluble. D’autres protocoles utilisant des traitements acides ou aqueux donnent accès à des molécules non humiques. Ces molécules sont décrites plus loin.

II.2.1 Les lipides

Les lipides jouent un rôle important dans les processus du sol (Stevenson, 1982) car ils affectent à la fois les plantes et la microflore et influencent les propriétés physiques du sol (Jambu et al., 1983). Les lipides ont une origine essentiellement végétale (Kolattukudy, 1980) avec une contribution bactérienne (Amblès et al., 1983). Ils peuvent, par ailleurs, provenir de la transformation, par les micro-organismes, de composés issus des végétaux (Amblès et al., 1985).

Considérés comme des précurseurs d’hydrocarbures pétroliers (Shimoyama et Johns, 1972) ou de kérogènes (Shioya et Ishiwatari, 1983), les lipides du sol ont fait l’objet de nombreuses études. En dépit d’importants progrès réalisés ces dernières années, la détermination de l’origine spécifique des différents types de kérogènes et leurs mécanismes

Les études précédentes, concernant les lipides du sol, ont montré que cette fraction soluble inclut des lipides simples, dits lipides libres, mais aussi une partie plus complexe, les lipides macromoléculaires (McCarthy et Duthie, 1962). Les lipides simples se composent principalement de différentes familles d’hydrocarbures (linéaires, ramifiés ou cycliques), de cétones, d’aldéhydes, d’alcools (linéaires ou stéroïdiques), d’acides mono- et dicarboxyliques, de cétoacides, d’hydroxyacides, d’esters et de cérides. Les lipides complexes sont des macromolécules polaires, peu solubles et donc difficilement analysables par les techniques classiques de chromatographie en phase gaz (CPG), précédées de dérivations. Leur étude nécessite donc l’emploi de méthodes de dégradation.

Les lipides du compost sont surtout étudiés lors du suivi du processus de compostage. Ils sont essentiellement analysés dans le cadre d’études sur l’activité microbienne (Klamer et Baath, 2004) ; (Steger et al., 2003) ou enzymatique (Ayuso et al., 1996). Les études réalisées sur les lipides libres totaux de divers matériaux en cours de compostage ont montré des variations différentes de la quantité de lipides. Mais l’évolution globale reste la même, à savoir, une diminution de la quantité totale de lipides dans le compost final par rapport au matériau frais (González-Vila et al., 1999; Marche et al., 2003).

Certains auteurs ont noté la présence, dans des composts de bio-déchets (Dignac et al., 2005b) ou de déchets urbains (González-Vila et al., 1999), de composés issus de polymères synthétiques. Le suivi de l’évolution de ces composés au cours de compostage et après épandage serait intéressant, dans la mesure où ils ne sont pas présents naturellement dans le sol.

Les lipides sont généralement extraits par un mélange Dichlorométhane/ Méthanol (Soxhlet, ultrasons, extraction sous pression) puis analysés de manière globale ou après fractionnement et séparation des différentes familles de composés.

Les lipides totaux sont analysés par CPG et CG/SM après dérivation, des alcools et acides en leurs ethers et esters triméthylsilylés (TMS) correspondants, avec du N,O- bis(triméthylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA), contenant 1% de trimethylchlorosilane (Naafs

et al., 2004a; Naafs et al., 2004b; Nierop et al., 2005). Du fait de la grande variété de

composés et des quantités très différentes, les chromatogrammes sont souvent complexes et difficiles d’interprétation.

Une autre méthode consiste à fractionner les lipides totaux en familles de polarités et de fonctions chimiques (McCarthy et Duthie, 1962). Les acides carboxyliques et les alcools sont ensuite respectivement méthylés et acétylés.

Certains auteurs utilisent des techniques SPE pour le fractionnement des lipides totaux (Bull et al., 1998; Fiorentino et al., 2006). La silice basique (McCarthy et Duthie, 1962) est remplacée par une cartouche contenant une phase aminopropyle et les lipides sont, de la même manière, séparés en fractions neutres et acides.

Les lipides libres sont aussi caractérisés dans des échantillons d’eau de diverses origines. Les méthodes les plus courantes sont des extractions liquide-liquide (Colina-Tejada

et al., 1996; Nash et al., 2005). Les résines XAD-2 sont aussi utilisées pour l’extraction (Elias et al., 2000). Xu et al. (2007) ont extrait les lipides de manière classique après lyophilisation

des échantillons d’eau. Suite à ces extractions, les méthodes de séparation et dérivation restent similaires à celles utilisées pour les lipides du sol. Poulain (2005) a développé des techniques des SPE permettant l’extraction des marqueurs d’origine (HAP, acides gras, stérols et alcanes) directement de l’échantillon aqueux.

II.2.2 Les substances humiques

Les substances humiques sont les matériaux organiques naturels les plus répandus dans les sols, l’eau et les sédiments. Elles sont considérées comme des structures chimiques complexes plus stables que leurs précurseurs et ayant perdu les caractéristiques chimiques de ces derniers. Les acides humiques et l’humine représentent généralement la majeure partie des substances humiques et semblent montrer des caractéristiques chimiques et des structures chimiques similaires (Schulten et Schnitzer, 1997). Les acides humiques des sols dérivent principalement de dégradations (bio)chimiques des résidus de plantes et d’animaux et de l’activité synthétique microbienne. Ils constituent une part significative de la matière organique des sols (20% de la MOS totale) (Grasset et Amblès, 1998a; 1998b; Schulten et Schnitzer, 1997).

L'évolution de la recherche concernant les substances humiques tend à envisager la structure de ces substances différemment. Ainsi Sutton et Sposito (2005) proposent une vision où les substances humiques seraient une collection de diverses structures moléculaires, de masse moléculaire relativement faible, formant des associations dynamiques stabilisées par

modèles d’acides humiques (Figure 1.4). L’étude de l’énergie des différents centres stéréochimiques de ces deux « blocs de construction » permet de déterminer la meilleure conformation et de proposer des oligomères liés par liaisons amides et/ou avec des saccharides.

Figure 1.4 : Structure moléculaire des monomères d’acides humiques dis (a) Steelink et (b) TNB (les centres chiraux sont mis en évidence en cycles ouverts).

Alvarez-Puebla et al. (2006) proposent un modèle d’acides fulviques (Figure 1.5), basé sur la molécule modèle TNB (Figure 1.5), et réalisé à partir de résultats expérimentaux, capable de s’aggréger de différentes manières selon le milieu (pH, état hydrique…).

Les substances humiques des sols sont obtenues par traitement alcalin (Ertel et Hedges, 1984). Le surnageant, appelé fraction humique ou extrait alcalin, contient la fraction fulvique (FF) et les acides humiques (AH) solubles en milieu basique. L’acidification de cet extrait entraîne une précipitation des acides humiques. La partie insoluble est composée de l’humine et de l’essentiel de la partie minérale. Les acides fulviques sont généralement purifiés sur résine XAD-8 ou par dialyse. Un concentré d’humine peut être obtenu sans trop de perte ou d’altération de la matière organique par dissolution des minéraux avec de l’acide fluorhydrique (Rumpel et al., 2006c).

La majorité des auteurs utilisent le même type de fractionnement pour isoler les substances humiques dans les composts (Amir et al., 2006; Réveillé et al., 2003; Veeken et

al., 2000).

La pyrolyse est utilisée pour l’étude structurale de la matière organique des sols, des sédiments ou des polymères. C’est une méthode rapide, directement applicable à un échantillon brut (roche, sol, plante…) ou aux fractions qui en sont issues. Ainsi, la pyrolyse a été utilisée pour l'étude des kérogènes de sédiments anciens (Larter et Horsfield, 1993), des lipides macromoléculaires des sols (Gobé et al., 2000), des tourbes (Guignard, 2001; Guignard et al., 2005) et des substances humiques (Del Rio et Hatcher, 1996; González-Vila

et al., 1994; Van Bergen et al., 1997).

Différentes méthodes sont employées, la plus courante (car la plus rapide) est la pyrolyse analytique (ou pyrolyse on-line). Cette méthode consiste à coupler un pyrolyseur à la chromatographie en phase gazeuse et à la spectrométrie de masse (Py-CG/SM). Dans le cas de la pyrolyse préparative (pyrolyse off-line), les pyrolysats obtenus sont piégés dans un solvant organique à -20°C puis injectés en CG/SM. L'avantage de la pyrolyse off-line est l'utilisation d'une quantité plus importante d'échantillon. Les pyrolysats ainsi récupérés en quantité suffisante peuvent être fractionnés par chromatographie liquide puis analysés par couplage GC/MS (Gobé, 1998; Grasset, 1997; Guignard, 2001; Largeau et al., 1986). Cette technique permet de quantifier les différentes familles de composés, et de mieux apprécier leur distribution en évitant les co-élutions.

Cependant les produits obtenus par pyrolyse sont fréquemment des composés polaires et peu volatils, qui ne sont pas analysables par chromatographie en phase gazeuse. De plus, beaucoup de produits peuvent être issus de réactions thermiques secondaires (Pouwels et al., 1989; Saiz-Jimenez et de Leeuw, 1987). Ces réactions secondaires semblent être minimisées

Une alternative est la pyrolyse avec méthylation in situ (Challinor, 1989) qui consiste à pyrolyser l'échantillon en présence d'un agent alkylant, généralement un hydroxyde de tétraalkylammonium en solution aqueuse ou méthanolique. L'utilisation d'un tel procédé évite la décarboxylation des acides et la déshydratation des alcools et diminue la polarité des produits de pyrolyse, facilitant ainsi leur analyse en CPG (Challinor, 1989; Del Rio et al., 1994).

Cette technique, développée dans un premier temps à une température de 770°C (Kossa et al., 1979), a été nommée Pyrolyse-Méthylation simultanée. Elle a ensuite été utilisée pour l'étude des polymères (Challinor, 1989), puis renommée thermochimiolyse par De Leeuw et Baas (1993) qui ont montré que cette réaction est plus une chimiolyse assistée thermiquement qu'une simple pyrolyse suivie d'une dérivation.

Plusieurs auteurs ont effectué des pyrolyses sur le compost ou ses fractions humiques et montrent la présence de motifs ligneux, de sucres et d’acides gras (Dignac et al., 2005b; González-Vila et al., 1999; Veeken et al., 2000).

L’agent alkylant le plus couramment utilisé est l’hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAH) en solution dans le méthanol (50/50 w/w). Les fonctions acides sont dérivées en esters méthyliques (mécanisme présenté sur la Figure 1.6), les amides et amines sont N- alkylées. Les phénols et les alcools sont transformés en éthers méthyliques.

Figure 1.6 : Mécanisme de formation des esters méthyliques lors de la thermochimiolyse en présence de TMAH. O O R _{O R} OH O R OH O OH R O O R O OMe O (CH3)4NOH + _(CH 3)4N N(CH3)4+ N(CH3)4 - + + - + - + - +

Lors de la thermochimiolyse avec TMAH, les acides gras ainsi que les composés estérifiés à la matrice sont libérés sous forme d’esters méthyliques. Il est impossible de distinguer les esters méthyliques qui étaient piégés dans le réseau macromoléculaire des acides reliés à la matrice par liaisons ester et libérés sous forme d’esters méthyliques.

L’utilisation de l’acétate de tétraéthylammonium (TEAAc) (Figure 1.7) comme agent alkylant permet de différencier les acides libres des esters méthyliques présents naturellement dans l’échantillon. En effet, le TEAAc est une base trop faible pour couper les liaisons esters et seuls les acides sont transformés en esters éthyliques.

R COOMe R COOH R COOMe R COOEt R O O O R O R COOMe

TEAAc Matrice TMAH

Figure 1.7 : Principe de la thermochimiolyse en présence de divers agents alkylants (TMAH et TEAAc).

II.2.3 Les substances non-humiques La cellulose

Directement issue de la photosynthèse, la cellulose est la molécule organique la plus abondante sur Terre ainsi que le matériau le plus important de la paroi des cellules végétales. La teneur varie selon l'espèce végétale, d'environ 40% dans le bois à 95-99% dans les fibres de coton. La cellulose est une macromolécule à très longue chaîne stéréorégulière et appartient à la famille des β-D-glucanes. Elle est constituée exclusivement d'unités β-D- glucose reliées entre elles par des liaisons de type β(1-4). L'unité répétitive, composée de l'association de deux glucoses, est appelée cellobiose (Figure 1.8).

Figure 1.8 : Représentation de la chaîne de cellulose.

Les hémicelluloses

Les hémicelluloses représentent, après la cellulose, le polysaccharide le plus abondant dans la nature. Contrairement à la cellulose, elles ne peuvent pas être décrites de façon succincte du fait de leur importante diversité. Elles diffèrent de la cellulose de par l’hétérogénéité de leur composition monosaccharidique. En général elles sont constituées de chaînes moléculaires plus courtes. Par extension, les hémicelluloses regroupent tous les polysaccharides qui ne sont ni cellulosiques, ni pectiques, présents dans les parois cellulaires végétales.

Par hydrolyse acide ou enzymatique, les hémicelluloses libèrent des hexoses (glucose, mannose, galactose), des pentoses (xylose, arabinose), des désoxyhexoses (fucose et rhamnose) et des acides uroniques (acide glucuronique et son dérivé 4-O-méthyle, acide galacturonique). Les liaisons qui unissent ces motifs sont elles-mêmes variées.

Les arbres à feuilles caduques contiennent ¾ de pentose et ¼ d’hexose. Ce rapport est inversé dans les conifères.

Les sucres dans la matière organique des sols

Les sucres présents dans la matière organique, des sols et composts, ont pour origine principale les deux polymères précédemment décrits (cellulose et hemicellulose). Ils peuvent également provenir des exsudats des plantes ou micro-organismes. Les méthodes pour les extraire sont donc très diversifiées et varient selon l’origine des sucres.

Les hydrolyses acides sont les méthodes les plus courantes pour la libération des sucres d’échantillons solides. Les acides chlorhydrique et sulfurique sont les plus couramment employés. Feller et al. (1991) ont comparé l’utilisation des deux acides. Les résultats

montrent que les deux hydrolyses, libèrent la même quantité de sucres totaux. L’acide chlorhydrique étant aussi employé lors de l’extraction des composés azotés, il peut être intéressant d’utiliser cette méthode dans le cadre de l’étude des sucres et acides aminés. Par contre l’acide sulfurique, à forte concentration, est plus efficace pour l’hydrolyse de la cellulose, malgré un risque de dégradation des pentoses. Les acides sont donc utilisés à forte concentration pour l’hydrolyse des sucres totaux, car ils permettent la dégradation de polymères très résistants (cellulose) et à concentration plus réduite lors de l’étude des sucres labiles et hemicellulosiques (Amelung et al., 1996; Bourdon et al., 2000; Puget et al., 1998).

Un autre type d’acide est lui aussi très utilisé lors de l’hydrolyse des carbohydrates. Il s’agit de l’acide trifluoroacétique (TFA). Il est utilisé à concentration moyenne pour l’hydrolyse des sucres non-cellulosiques et libres. L’avantage du TFA est d’offrir un meilleur rendement que l’acide sulfurique et de permettre l’évaporation directe de l’acide.

Les sucres libres peuvent par ailleurs être extraits à l’eau (froide ou chaude) (Martens et Frankenberger, 1990; Puget et al., 1998).

Des méthodes employant les ultrasons ou les micro-ondes sont aussi utilisées, notamment pour l’étude des sucres dans les sédiments marins (Kornilova et Rosell-Mele, 2003; Mecozzi et al., 2000).

Les sucres sont quantifiés de manière globale ou individuelle. Les méthodes de quantification globales sont des techniques spectroscopiques. Les méthodes colorimétriques les plus utilisées sont la méthode anthrone-acide sulfurique et la méthode de Dubois et al. (1956) (phénol-acide sulfurique). La méthode au phénol présente l’avantage, pour les oses totaux, d’une réponse plus homogène et surtout moins sous-estimée de chaque monosaccharide par rapport à une gamme étalon de glucose, notamment des pentoses (Feller

et al., 1991). La méthode de Dubois semble par ailleurs plus répétable. La méthode à

l’anthrone est spécifique pour la détermination des hexoses (Deng et Tabatabai, 1994).

La quantification des sucres individuels se fait par chromatographie liquide ou en phase gaz après dérivation. Deux techniques de dérivation sont couramment employées : la silylation et la réduction-acétylation.

La silylation la plus efficace utilise du BSTFA, contenant 1% de triméthylchlorosilane avec de la pyridine comme solvant. La pyridine peut être remplacée par l’aniline qui offre une meilleure stabilité des dérivés et des temps de réactions plus courts (Rojas-Escudero et al., 2004), mais il devient alors nécessaire d’utiliser davantage de BSTFA.

L’acétylation des alditols permet d’éliminer le centre anomérique et ainsi simplifier les chromatogrammes, car chaque sucre produit un pic. Ceci est très intéressant lors de l’extraction directe des sols car le taux de matière organique y est généralement faible. Un autre avantage est que les échantillons après hydrolyse ne nécessitent pas de purification préalable. Avec cette méthode tous les sucres neutres, excepté le fructose sont détectés. En effet, le fructose est transformé en « glucose » après réduction. Le fructose n’étant peu ou pas présent dans les sols (Amelung et al., 1996), ceci n’est donc pas un problème à l’analyse des sucres.

Les sucres identifiés dans les sols ou les substances humiques sont le rhamnose, fucose, mannose, arabinose, xylose, glucose, ribose, galactose (Figure 1.9) (Bourdon et al., 2000; Koivula et Hanninen, 2001; Larre-Larrouy et Feller, 1997; Mecozzi et Pietrantonio, 2006; Rumpel et Dignac, 2006b; Trouvé et al., 1996). Les ratios C6/C5 (mannose/galactose)/(xylose/arabinose) et deoxy/C5 (rhamnose/fucose)/(xylose/arabinose) ont été définis pour l’apport en carbohydrates des plantes (< 0.5) et microbiens (> 2) (Guggenberger et Zech, 1994; Murayama, 1984; Oades, 1984).

Figure 1.9 : Chromatogramme d’une solution standard de sucres dérivés en alditols acétylés (Rumpel et Dignac, 2006b).

Bourdon et al. (2000) ont estimé une origine essentiellement :

_ hémicellulosique pour le xylose >> arabinose > glucose (hémicellulosique) _ microbienne pour le mannose > fucose > rhamnose.

Les composés azotés

Les composés azotés les plus abondants sont les protéines. Ce sont des polymères constitués par la formation de liaisons peptidiques entre les acides aminés neutres (Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Proline, Phényl-alanine, Glycine, Threonine, Sérine et Tyrosine), acides (acide Aspartique et Acide glutamique) et basiques (Lysine et Arginine). Allard (2006) a observé que 60% des acides aminés contenus dans les acides humiques d’un sol cultivé sont des acides aminés neutres. Le sol total quant à lui contient qualitativement les mêmes composés, mais dans des quantités différentes. Andersson et al. (2000) ont observé, dans un sédiment marin, essentiellement des acides aminés neutres et acides. Les acides aminés basiques semblent eux davantage liés aux argiles (notamment les smectites). En effet, les propriétés basiques de l’Arginine (pKa du groupement guanidinium = 12,48) lui permettent de se lier plus facilement (Laird et al., 2001a).

Issus des protéines, les acides aminés sont une composante importante de la matière organique et jouent un rôle important dans le cycle de l’azote (Jones et al., 2004).

Que ce soit sur des échantillons solides (Allard, 2006; Amelung et al., 2006; Poirier et

al., 2005) ou aqueux (Jones et al., 2005), les acides aminés sont généralement libérés par

hydrolyse avec de l’acide chlorhydrique 6M.

Les micro-organismes sont connus pour synthétiser une variété de D-acides aminés libres ou solubles (Nagata et al., 1998), ces acides aminés libres peuvent être extraits avec HCl 1M (Amelung et al., 2006).

Les méthodes utilisées pour quantifier les acides aminés varient selon les auteurs : HPLC (Jones et al., 2005; Poirier et al., 2005) ou CPG après dérivation en N- heptafluorobutyryl isobutyl esters (Allard, 2006) ou N-pentafluoropropionyl isopropyl esters (Amelung et al., 2006). Une troisième méthode consiste à dériver les acides aminés par acylation-alkylation, en utilisant du chloroformiate d’éthyle (Husek, 1991; Rodier et al., 2001). Les avantages de cette méthode sont de pouvoir dériver les acides aminés directement dans l’eau et de pouvoir séparer les énantiomères (utilisation d’un agent dérivant chiral : le chloroformiate de menthyle).

Les lignines

La lignine a été, dans un premier temps, identifiée par les chimistes comme le résidu insoluble de l'hydrolyse acide du bois, il y a 150 ans. Il y a seulement 50 ans que la structure polymérique de la lignine est envisagée. Le terme de lignine est désormais utilisé au pluriel. Ceci montre la conscience croissante au sujet de la variabilité naturelle des "lignines". Ceci illustre aussi la complexité de la lignine en tant que polymère, liée à la compostition moléculaire et l'organisation moléculaire de ses nombreux modèles (Monties, 1998).

Les lignines sont considérées comme une source majeure dans la formation des substances humiques. Leur incorporation se produit par de légères modifications de la structure des biopolymères (afin d'accroître leur solubilité), ou par la dégradation, suivies de repolymérisation (Ertel et Hedges, 1984).

Les lignines sont des polyphénols, macromolécules tridimensionnelles hydrophobes de haut poids moléculaire, qui représentent le deuxième constituant le plus abondant dans le bois. Dans leur état natif (non modifié ou non déstructuré), on parle de protolignines. Les différents éléments structuraux détectés dans les protolignines proviennent, de l'oxydation des alcools p- hydroxycinnamiques, à savoir les alcools p-coumaryliques, coniféryliques et sinapyliques (Figure 1.10). La proportion des trois monomères et les liaisons intramoléculaires sont très variables, dépendantes de l’origine botanique, du tissu et de la localisation dans la paroi.

La structure des lignines est très complexe du fait de la présence de nombreux types de liaisons entres les diverses unités C-9. Les plus rencontrées sont répertoriées sur la Figure 1.11.

Figure 1.11 : Liaisons les plus rencontrées dans les lignines (Brunow et al., 1999).

Les lignines sont difficilement dégradées, très résistantes à de nombreux agents chimiques et biochimiques. Seules certaines bactéries et champignons, comme les Polyphores, sont capables d’assurer la lignolyse. Par ailleurs, les lignines sont insolubles dans les solvants. Contrairement à d'autres polymères de végétaux, telle que la cellulose pour lesquels une formule structurale générale existe, la structure des lignines ne peut pas être définie de manière claire par la répétition d'unités caractéristiques car elles sont liées entre elles de façon désordonnée.

De nombreuses études utilisent l'oxydation à l’oxyde de cuivre (CuO) pour libérer les monomères phénoliques de la lignine (Ertel et Hedges, 1984). Les composés libérés sont des aldéhydes, des cétones et des acides dérivant du phénylpropane. On distingue alors les