Etude préliminaire

La libération de la protéine Hsp12 native lors de la fermentation et de l’autolyse induite de la souche Fx10 est évaluée au préalable. L’objectif est de pouvoir mimer au mieux les conditions de vinification lors la préparation des échantillons destinés à l’établissement du profil sensoriel.

Deux cultures de la souche Fx10 sont réalisées avec du moût blanc de raisin. La fermentation est menée pendant 11 jours jusqu’à épuisement des sucres. Puis, l’autolyse des levures est induite par augmentation de la température. Des prélèvements de culture sont réalisés tous les jours. La protéine Hsp12 est ainsi quantifiée dans le moût (Figure 67).

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Figure 67 : Suivi de la concentration de la protéine Hsp12 au cours de la fermentation alcoolique et de l’autolyse des levures.

Pendant les 11 premiers jours, la protéine Hsp12 n’est pas détectée dans le moût. Elle n’est donc pas libérée dans le moût lors de la fermentation alcoolique. Le 12^ème jour, la quantité de protéine Hsp12 a augmenté de façon importante à 8 µg/L. Il y a donc eu libération de la protéine Hsp12 dans le moût suite à l’autolyse des levures. Puis, la concentration en protéine Hsp12 diminue le 13^ème jour (1,2 µg/L) et elle n’est plus détectée le 14^ème jour, soit après 3 jours d’autolyse. Il est possible que la protéine Hsp12 soit dégradée dans le milieu par des protéases. En effet le dosage ELISA ne permet pas de quantifier les peptides issus de la protéine entière. Les protéases peuvent être déjà présentes dans le moût de raisin ou bien libérées par les levures suite à l’autolyse. Pour rappel, lors de la validation de la méthode de dosage ELISA, la protéine Hsp12 n’avait pas été détectée dans plusieurs vins commercialisés, probablement suite à sa protéolyse rapide dès sa libération dans le moût. Il semblerait donc que la protéine Hsp12 sous sa forme entière n’est présente que transitoirement au cours de la vinification.

En conclusion, afin d’évaluer l’impact gustatif des peptides de la protéine Hsp12, cette dernière devra être ajoutée au moment de l’autolyse des levures afin de représenter au mieux les conditions de vinification.

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4.2 Préparation des échantillons

Fermentation

4.2.1

Trois cultures d’une souche de Saccharomyces cerevisiae dont le gène HSP12 est inactivé (souche ΔHSP12) sont réalisées avec 450 mL de moût blanc de raisin. L’utilisation de cette souche ΔHSP12 permet de s’affranchir de la protéine Hsp12 libérée naturellement par les levures dans la culture et ainsi d’évaluer l’impact gustatif d’une quantité connue de protéine Hsp12. La fermentation est réalisée à 24°C. Le suivi de la croissance des levures est réalisé par la mesure de la densité optique (DO à 600 nm) (Figure 68).

Figure 68 : Suivi de la croissance des levures lors de la fermentation.

Les trois cultures présentent un profil de croissance similaire. Une forte augmentation de la biomasse est observée lors des premiers jours. Puis la quantité de biomasse reste stable jusqu’au 6^ème jour, avant de diminuer légèrement jusqu’au 11^ème jour.

Le suivi de la fermentation est réalisé grâce à la pesée des cultures. En effet, la consommation des sucres fermentescibles conduit à la libération de CO2, qui va entrainer une perte de masse. Pour 450 mL de moût, la consommation de 86 g de glucose et de fructose conduit à une libération de 42 g de CO2. La perte de masse est associée directement à la libération de CO2, ce qui permet de calculer la quantité de sucres dans le moût (Figure 69).

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Figure 69 : Suivi de la quantité de sucres dans le moût lors de la fermentation.

Les trois cultures montrent un profil similaire pour le suivi de la quantité de sucres dans le moût. Il y a une consommation rapide des sucres les premiers jours, puis une stabilisation à partir du 7^ème jour à environ 84 g. La fermentation est arrêtée le 11^ème jour car la totalité des sucres est consommée (86 g). Cela est vérifié par un dosage enzymatique montrant qu’il reste 0,023 g de glucose dans chaque culture. L’autolyse est donc induite dans les cultures, afin de mimer au mieux les conditions de vinification.

Autolyse

4.2.2

Le moût fermenté est séparé en 2 modalités. Dans la modalité 1, il n’y a pas d’ajout et dans la modalité 2, la protéine Hsp12 purifiée est ajoutée à une concentration de 30 mg/L. L’ajout de protéine Hsp12 correspond ici au moment où elle est libérée dans le vin lors de la vinification (cf. 4.1 Etude préliminaire). Les cultures sont ainsi placées en condition anaérobie à 32°C. Ces conditions favorisent l’autolyse des levures, qui vont ainsi libérer leur contenu intracellulaire. La protéine Hsp12 est quantifiée au cours du temps dans les milieux de culture par dosage ELISA (Tableau XIV).

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Tableau XIV : Quantification de la protéine Hsp12 par dosage ELISA dans les milieux de culture des modalités 1 et 2. Modalité 1 Modalité 2 Quantité ajoutée 0 30 mg/L Autolyse J0 0 1,5 mg/L Autolyse J1 0 0,008 mg/L Autolyse J2 0 0

La modalité 1 permet de confirmer qu’il n’y a pas de protéine Hsp12 libérée dans le milieu avec la souche HSP12. Pour la modalité 2, la quantité de protéine Hsp12 diminue rapidement suite à son ajout et jusqu’à ne plus être détectable à J2. La protéine Hsp12 est probablement dégradée par des protéases présentes dans le milieu. Le vin est alors centrifugé et filtré pour éliminer les levures.

Juste avant la dégustation, la modalité 1 est divisée en 2 modalités afin d’étudier la protéine Hsp12 entière, non digérée. Dans la modalité 1A, rien n’a été ajouté et dans la modalité 1B, la protéine Hsp12 pure a été ajoutée à une concentration de 30 mg/L. Les 3 modalités sont représentées ci-après (Figure 70).

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4.3 Profil sensoriel

Le profil sensoriel est réalisé sur les 3 modalités décrites précédemment. Pour chaque modalité, les dégustateurs ont évalué l’intensité de 3 descripteurs : sucrosité, acidité et amertume. Trois analyses statistiques ANOVA sont donc nécessaires pour analyser chaque descripteur.