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Electrophorèse monodimensionnelle en conditions natives (PAGE)

Chapitre II. Matériels et méthodes

2. Méthodes expérimentales

2.2. Analyse par électrophorèse native (PAGE) d’isoenzymes de GPOX, CAT et de SOD

2.2.4. Electrophorèse monodimensionnelle en conditions natives (PAGE)

L’étude du polymorphisme enzymatique et donc de la variabilité génétique entre cultivars est possible grâce à l’électrophorèse. Cette technique nous permet de suivre les modifications des profils isoenzymatiques des antioxydants enzymatiques (SOD, GPOX, CAT) sous conditions de stress. Les variations ainsi enregistrées constitueront un véritable marqueur du stress oxydatif (Lepeduš et al., 2004).

2.2.4.1. Extraction des enzymes

L’extraction de la catalase est réalisée selon le protocole décrit par Pérez & Lira (2005). Les feuilles de blé dur (~ 500 mg) sont broyées dans de l’azote liquide jusqu’à obtention d’une poudre fine, qui sera récupérée dans des tubes Eppendorf de 2 ml. 1 ml de tampon d’extraction [Tris-HCl 0.5 M (pH 7.5), DTT 5 mM, MgCl2 1 mM, PMSF 10 µM PVP insoluble 2% et du glycérol 12.5%] est ajouté au matériel végétal broyé. L’ensemble est ensuite vortexé puis centrifugé (15 min, 13000 g, 4 °C). Le culot obtenu est resuspendu dans le même tampon + Triton-X 100 à 2%. Après une incubation de 15 min à 30 °C, l’homogénat est centrifugé une deuxième fois (15 min, 13000 g, 4 °C). Les surnageants sont ensuite récupérés et placés dans de nouveaux tubes à 4 °C.

L’extraction des POX et des SOD est réalisée d’après une méthode adaptée de Valizadeh

et al. (2011) citée par Naderi et al. (2014). 1 ml de tampon d’extraction [Tris-HCl 50 mM (pH

7.5), saccharose 5%, acide ascorbique 50 mM, métabisulfite de sodiuem 20 mM, PEG 6000 (2%) et 2-mercaptoethanol 0.1%] est ajouté dans des tubes de 2 ml contenant au préalable 500 mg de matériel végétal frais broyé. L’ensemble est ensuite vortexé puis centrifugé (10 min, 12000 g, 4 °C). Les surnageants obtenus sont placés dans de nouveaux tubes à 4 °C.

Les extraits enzymatiques obtenus après extraction sont directement utilisés pour l’analyse en PAGE.

2.2.4.2. Séparation des isoenzymes par gel d’électrophorèse

2.2.4.2.1. Préparation des gels d’électrophorèse

Les différents extraits enzymatiques provenant des feuilles de blé dur sont soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) selon le système de Laemmli (1970) sans l’ajout de SDS.

Les isoformes de catalase sont séparées sur un gel non dénaturant de 7 % (Tableau 5-A) suivant le protocole de Pérez & Lira (2005) avec quelques modifications. Les isoenzymes de

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SOD et de POX sont séparées respectivement sur un gel non dénaturant de 10 % et de 7,5 % selon la méthode décrite par Naderi et al., (2014). Le gel est préparé avec le tampon de Poulik (1957) (Tableau 5-B pour les SOD) (Tableau 5-C pour les POX) cité par Wendel & Weeden. (1989). Dans chaque échantillon à analyser sont ajoutés 3 µl du tampon d’extraction approprié contenant des traces de bleu de bromophénol, qui est utilisé comme marqueur de migration. Les échantillons sont ensuite vortexés puis déposés dans les puits.

2.2.4.2.2. Conditions de migration

Le tampon d’électrophorèse préparé pour la migration des CAT est composé de Tris 250 mM et glycine 1,92 M (pH 8,3) sans urée et SDS. Celui des SOD et des GPOX (pH 8,8) contient du Tris 32 mM, Na2EDTA 0,1 Mm et de l’acide borique 0,6 mM.

La migration est effectuée dans une cuve d’électrophorèse verticale H-Vertigel 2 de dimensions 20 x 20 cm (Apelex) à un voltage constant (70 V) et une température de 4 °C jusqu’à ce que le front de migration atteigne le bas du gel.

2.2.4.2.3. Révélation de l’activité enzymatique sur gel

La révélation de l’activité des CAT est effectuée selon la méthode de Woodbury et al., (1971) citée par Fath et al., (2002). Le gel est d’abord immergé dans l’eau distillée pendant 15 min. Apres lavage, il est incubé dans l’H2O2 à 0.03% pendant 5 min sous agitation douce puis lavé délicatement dans de l’eau distillée afin d’éliminer les résidus d’H2O2. L’activité de la catalase est révélée en trempant le gel à l’obscurité dans une solution contenant du chlorure ferrique à 1% (w/v) et de ferricyanure de potassium à 1% (w/v). Le réactif, le ferricyanure de potassium, réagit avec l'eau oxygénée, ce qui donne une coloration bleue verte. Ainsi, lorsque la catalase est absente dans le gel, ce dernier présente une coloration bleue verte. Les bandes claires (achromatiques) dans un gel bleu-vert, traduisent la présence de la catalase dans le gel. Lorsque le contraste maximal est atteint, la réaction est stoppée en rinçant le gel plusieurs fois à l’eau distillée.

Après migration, l’activité de la SOD est révélée en trempant le gel dans une solution de Tris-HCL (50 mM, pH 8,0) contenant : 2 mg de Riboflavine, 1 mg EDTA et 10 mg de NBT pour un volume final de 50 ml (Wendel & Weeden 1989). Après une incubation de 30 min à l’obscurité et sous agitation, le gel est éclairé sous une lumière blanche. Le NBT se colore en présence du superoxyde généré par l’oxydation de la riboflavine à l’air ambiant. La disparition du superoxyde résultant de l’activité de dismutation des SOD se traduit par une décoloration du NBT à l’emplacement de la SOD.

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Tableau 5 : Composition du gel d’électrophorèse pour la séparation des CAT (A), SOD (B) et GPOX (C) (A)

Solutions stocks Gel de séparation (7 %) Gel de concentration (4 %)

Acrylamide/bis (40 %) 9,4 mL 1 mL Tris-HCl (1,5 M, pH 8,3) 12,5 mL ̷ Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) ̷ 2,5 mL APS (10%) 250 µL 50 µL TEMED 50 µL 10 µL H2O distillée 27,8 mL 6,44 mL (B)

Solutions stocks Gel de séparation (10%) Gel de concentration (4 %)

Acrylamide/bis (40 %) 12,5 mL 1 mL Tris-citrate (0,076 M, pH 8,6) 12,5 mL ̷ Tris-citrate (0,076 M, pH 6,8) ̷ 2,5 mL APS (10%) 250 µL 50 µL TEMED 50 µL 10 µL H2O distillée 24,7 mL 6,44 mL (C)

Solutions stocks Gel de séparation (7,5%) Gel de concentration (4 %)

Acrylamide/bis (40 %) 9,37 mL 1 mL Tris-citrate (0,076 M, pH 8,6) 12,5 mL ̷ Tris-citrate (0,076 M, pH 6,8) ̷ 2,5 mL APS (10%) 250 µL 50 µL TEMED 50 µL 10 µL H2O distillée 27,83 mL 6,44 mL

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Les zones de l’activité SOD apparaissent comme des bandes achromatiques sur un bleu foncé. Le gel est ensuite lavé abondamment à l’eau distillée.

Enfin, La révélation de l’activité des GPOX est réalisée selon la méthode de Baaziz. (1989) avec quelques modifications. Le gel est trempé dans une solution de guaïacol 0.12 M préparée dans un tampon acétate (0.1 M pH 5,0) pendant 5 min sous agitation douce. La réaction des POX avec le guaïacol est ensuite déclenchée par addition de 1 ml de H2O2 (1%). Le gel est ensuite incubé à 40 °C, jusqu'à l’apparition de zones de couleur rouge brique témoignant la présence de l’activité peroxydase, puis lavé à l’eau distillée et fixé dans une solution de méthanol-H2O-acide acétique (5 : 5 : 1) (v/v/v). Les gels sont ensuite observés à l’aide de Image Scanner III (GE Healthcare).