Effet de wAjap sur le transcriptome ovarien d’A. japonica

a) Obtention et pré-analyse des transcriptomes ovariens d’A. japonica Elevage, traitement antibiotique et dissections

Afin de s’assurer que les parasitoïdes utilisés pour le séquençage des transcriptomes se développent dans des conditions homogènes, la température (21 °C), le nombre de parents (deux femelles A. japonica par tube), et le nombre d’hôtes (100 œufs de Drosophila

melanogaster, déposés sur 1,5 g de milieu standard, par tube) ont été contrôlés. Les traitements

antibiotiques ont été réalisés par l’ajout de 150 μL de rifampicine à 1 % sur le milieu des drosophiles. A l’émergence, les femelles ont été placées dans des tubes contenant du miel et du coton humide pendant cinq jours, afin de permettre la complète maturation des ovaires. Les ovaires des femelles ont alors été disséqués dans du tampon A ([KCl] = 25mM, [MgCl2] =

10mM, [Sucrose] = 250mM, [Tris] = 35mM, pH = 7.5) et stockés à -80°C jusqu’à l’extraction d’ARN. Chaque échantillon correspond à un pool de 20 paires d’ovaires.

Extraction des ARN totaux

A chaque échantillon ont été ajoutés 350 μL de tampon de dispersion (guanidine thiocyanate 4 M, disodium citrate 30 mM, β-mercaptoéthanol 30 mM). Les échantillons ont ensuite été broyés au moyen d’un Tissuelyser (3 min, 25 Hz). Après centrifugation (16000 g, 5 min, 4 °C) le surnageant a été transféré dans un nouveau tube. Les échantillons ont été placés dans la glace, et 330 μL de phénol-chloroforme-alcool isoamylique pH 8 ont été ajoutés. Les échantillons ont été vortexés 4 fois pendant 10 sec (avec des intervalles d’une minute). Après centrifugation (16000 g, 30 min, 4 °C), la phase supérieure, aqueuse, a été récupérée, et 1 μL de glycogène, puis 400 μL d’éthanol à 96 % ont été ajoutés afin de précipiter les acides nucléiques. Après homogénéisation et centrifugation (16000 g, 10 min, température ambiante), le précipité a été lavé à l’éthanol (80 %, 0,5 mL) puis séché. De manière à précipiter sélectivement les ARN totaux, le précipité a ensuite été dissous dans 100 μL d’eau ultrapure et, après ajout de 100 μL de chlorure de lithium, placé 1 h à -20 °C. Après centrifugation (16000 g, 15 min, température ambiante), le précipité a de nouveau été lavé à l’éthanol (80 %, 0,5 mL) et séché. Le surnageant a alors été dissous dans 30 μL d’eau ultrapure. Un traitement à la DNAse (Turbo-DNAse free, Ambion) a été effectué : après ajout d’1 μL de DNAse et de 3 μL de tampon, les échantillons ont été incubés à 37 °C pendant 30 min. Le tampon d’inactivation a ensuite été ajouté (3,4 μL) et l’échantillon a été incubé à température ambiante pendant 5 min. Après centrifugation (11000 g, 1 min, température ambiante), 30 μL de surnageant ont été récupérés. L’intégrité des ARN a été vérifiée par électrophorèse capillaire sur Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies).

Séquençage

Les différentes étapes de la préparation des librairies Illumina (sélection des ARNm eucaryotes, fragmentation, synthèse des ADNc, amplification par PCR et purification), ainsi que le séquençage HiSeq 2000/2500 v3 (high-output) ont été réalisés par Eurofins. Le séquençage a été réalisé en paired-end (lectures de 2 x 100 paires de bases). La couverture moyenne était de 22 millions de lectures par échantillon.

Assemblage, clustering et comptage

Deux assemblages ont été réalisés à l’aide de Trinity (Grabherr et al. 2011 ; longueur minimale des contigs : 240 pb ; k-mer : 32 pb) : un pour chaque lignée (tableau 3.3). Afin de procéder à l’analyse différentielle, il a donc été nécessaire d’identifier les transcrits orthologues dans les deux lignées. Le programme Silix (Miele et al. 2011) a été utilisé dans ce but. Silix regroupe les transcrits sur un critère de ressemblance (blast, e-value < 10^-5) au sein de clusters ou familles géniques. Silix peut donc regrouper des paralogues aussi bien que des orthologues. Pour éviter ce problème, seules les familles contenant deux transcrits – un appartenant à chaque lignée – ont été conservées dans la suite de l’analyse (soit 5604 familles). Le comptage des transcrits a été réalisé à l’aide des programmes Bowtie (Langmead et al. 2009) et RSEM (Li & Dewey 2011). L’annotation fonctionnelle des transcrits a été réalisé à l’aide du programme Blast2GO (Conesa et al. 2005). Les recherches de similarités ont été réalisées par un BLASTX contre les séquences protéiques de GenBank, et une assignation de termes de la Gene Ontology (GO) a été effectuée. Dans le cadre de la Gene Ontology, les gènes sont classés en fonction (i) des composants cellulaires auxquels ils s’appliquent, (ii) de leurs fonctions moléculaires, et (iii) des processus biologiques auxquels ils prennent part. Les étapes de l’analyse bioinformatique des données transcriptomiques décrites ci-dessus ont été réalisées par Adil El Filali (LBBE). L’ensemble du protocole est résumé dans la figure 3.1.

Assemblage Nombre de gènes N50 % de gènes annotés en BLASTX

Iriomote 29396 2806 58

Kagoshima 34112 2597 54

Tableau 3.3. Assemblages des transcriptomes ovariens d’A. japonica (lignée arrhénotoque : Iriomote ; lignée thélytoque : Kagoshima ; N50 : longueur de contig telle que la moitié de l’assemblage, en termes de nombre de nucléotides, est constitué de contigs de longueur supérieure ou égale).

Figure 3.1. Protocole mis en œuvre pour l’étude des transcriptomes ovariens d’A. japonica.

b) Analyse différentielle

Les analyses différentielles ont été réalisées à l’aide de la bibliothèque DESeq2 (Love et al. 2014) et du logiciel R, version 3.2.4 (R Core Team 2016). Ont été considérés différentiellement exprimés les transcrits dont la probabilité critique ajustée (False Discovery

Rate) associée était inférieure à 5 %. Les transcrits dont la moyenne des comptages (sur les huit

échantillons) était strictement inférieure à 10 ont été exclus de l’analyse différentielle. Au final, seulement 1891 transcrits (sur 5604) ont donc été conservés. Le modèle statistique utilisé avait pour variables explicatives les facteurs traitement, lignée, et leur interaction. Une normalisation

a été effectuée, par la couverture (nombre de lectures par échantillon) et par la longueur des transcrits. En effet, en raison des assemblages séparés, les transcrits appartenant à une même famille – donc supposés orthologues – n’ont pas nécessairement la même longueur dans les deux lignées.

L’analyse différentielle montre que les différences d’expression entre lignées sont très fortes, tandis que les différences d’expression entre modalités de traitement – au sein d’une lignée donnée – sont faibles (voir figure 3.2). Ainsi, en absence de traitement, 29 % des transcrits (549 / 1891) étaient surexprimés dans la lignée Kagoshima relativement à la lignée Iriomote, tandis que 28,8 % (545) étaient sous-exprimés. En condition de traitement antibiotique, 30,7 % des transcrits (580) étaient surexprimés dans la lignée Kagoshima relativement à la lignée Iriomote, tandis que 29,9 % (566) étaient sous-exprimés. Plus de 85 % des gènes différentiellement exprimés entre les deux lignées l’étaient dans les deux conditions de traitement. Au sein de la lignée Kagoshima, 3 % des transcrits (56) étaient surexprimés sous l’effet du traitement antibiotique, et 3,1 % (59) étaient sous-exprimés. Au sein de la lignée Iriomote, 0,6 % des transcrits (11) étaient surexprimés sous l’effet du traitement antibiotique, et 3 % (56) étaient sous-exprimés. On retrouve donc plus de gènes différentiellement exprimés sous l’effet du traitement antibiotique chez Kagoshima que chez Iriomote (115 contre 67). Cela n’est pas surprenant puisque dans la lignée Kagoshima, on observe l’effet direct de l’antibiotique sur la physiologie de l’hôte – ce qui est également le cas pour la lignée Iriomote –, mais aussi son effet indirect, lié à l’élimination de Wolbachia. En réponse au traitement antibiotique, 5 gènes étaient surexprimés, et 31 sous-exprimés, simultanément chez Kagoshima et Iriomote (voir figure 3.3).

Figure 3.2. Analyse différentielle des transcriptomes ovariens d’A. japonica, avec indication du pourcentage de gènes surexprimés (en rouge) et sous-exprimés (en bleu) dans la modalité vers laquelle pointe la flèche par rapport à la modalité d’où part la flèche.

Figure 3.3. Diagramme de Venn des gènes différentiellement exprimés (dans le même sens) dans les différentes comparaisons de l’analyse des transcriptomes ovariens d’A. japonica (Iriomote : lignée arrhénotoque ; Kagoshima : lignée thélytoque ; AB : traitement antibiotique ; NT : pas de traitement). Les gènes utilisés pour l’analyse fonctionnelle de l’effet proximal et de l’effet ultime de Wolbachia (voir section c) sont encadrés respectivement en bleu et en rouge.

L’analyse en composante principale (ACP) des données de comptage confirme ce résultat : le premier axe, qui explique 92 % de la variance totale, sépare nettement les échantillons selon leur lignée, tandis que le deuxième axe, qui n’explique que 4 % de la variance totale, sépare les échantillons selon leur modalité de traitement (voir figure 3.4).

Figure 3.4. ACP sur les données des transcriptomes ovariens d’A. japonica. I : Iriomote (arrhénotoque), K : Kagoshima (thélytoque), AB : traitement antibiotique, NT : pas de traitement.

c) Analyse fonctionnelle

Compte tenu du nombre important de gènes différentiellement exprimés, une analyse fonctionnelle basée sur la Gene Ontology a été effectuée afin de synthétiser cette information.

L’analyse fonctionnelle a été réalisée à l’aide de la bibliothèque goseq (Young et al. 2010). Les termes GO ont été considérés significativement enrichis lorsque leur probabilité critique associée était inférieure à 5 % (FDR).

Afin de s’affranchir de l’effet direct de l’antibiotique sur l’hôte, et ainsi de caractériser l’effet proximal de Wolbachia, nous nous sommes intéressés à l’effet de l’antibiotique chez la lignée infectée (Kagoshima) auquel nous avons soustrait l’effet de l’antibiotique chez la lignée non infectée (Iriomote). Cette soustraction peut être effectuée de deux manières différentes. La première possibilité est de sélectionner, en amont de l’analyse fonctionnelle, les gènes différentiellement exprimés sous l’effet de l’antibiotique chez Kagoshima mais pas chez Iriomote (ou bien différentiellement exprimés chez Iriomote, mais dans le sens opposé, e.g., surexprimés plutôt que sous-exprimés). La deuxième possibilité est de réaliser deux analyses fonctionnelles, l’une avec les familles différentiellement exprimées sous l’effet de l’antibiotique chez Kagoshima et l’autre chez Iriomote, et de soustraire aux termes GO enrichis dans la première analyse ceux qui le sont également dans la seconde.

Ces deux approches donnent des résultats convergents, et seuls ceux obtenus avec la première (soustraction en amont de l’analyse fonctionnelle, voir figure 3.3) seront détaillés. L’analyse goseq de l’ensemble des gènes surexprimés chez Kagoshima AB relativement à Kagoshima NT – mais pas chez Iriomote AB relativement à Iriomote NT – identifie 4 termes GO significativement enrichis : translation, structural constituent of ribosome, ribosome

biogenesis et ribosome. On note en particulier la surexpression de 16 gènes codant pour des

protéines ribosomales en réponse à l’élimination de Wolbachia. Parmi les gènes sous-exprimés (toujours chez Kagoshima AB relativement à Kagoshima NT mais pas chez Iriomote AB relativement à Iriomote NT), goseq n’identifie aucun terme significativement enrichi.

La traduction semble donc être le principal processus biologique influencé par la présence de wAjap chez A. japonica. Un effet de l’élimination de Wolbachia sur la traduction a déjà été mis en évidence chez des nématodes. Chez Brugia malayi, une surexpression des gènes impliqués dans la traduction a été observée au 7^ème et au 14^ème jour suivant le traitement antibiotique (Ghedin et al. 2009). Les auteurs interprètent ce résultat comme la conséquence d’un stress dû à la perte de Wolbachia, plus précisément à la pénurie de nutriments que celle-ci fournit habituellement à son hôte. Au contraire, une sous-expression de ces gènes est observée après un délai plus long, chez B. malayi, 6 semaines après le traitement (Rao et al. 2012), et chez Litomosoides sigmodontis, au 36^ème jour suivant le traitement (Strübing et al. 2010). Ce résultat indiquerait, d’après Strübing et al. (2010), que le nématode échoue finalement à

compenser la perte de son symbiote. Etant donné qu’aucune dépendance nutritionnelle à

Wolbachia n’a été mise en évidence chez A. japonica, cette explication ne peut

vraisemblablement pas être étendue à ce modèle biologique.

Nous avons également essayé de déterminer l’effet ultime de l’infection par Wolbachia, c'est-à-dire les conséquences de la coévolution. Pour ce faire, une première possibilité est de rechercher les termes GO enrichis parmi l’ensemble des gènes différentiellement exprimés entre Kagoshima NT et Iriomote NT ou entre Kagoshima AB et Iriomote AB. Une deuxième possibilité, plus stringente, consiste à rechercher les termes GO enrichis parmi l’ensemble des différentiellement exprimés entre Kagoshima NT et Iriomote NT et entre Kagoshima AB et Iriomote AB. Une dernière possibilité, qui permet de s’affranchir complètement de l’effet proximal de Wolbachia, est de rechercher les termes GO enrichis dans l’ensemble des gènes différentiellement exprimées Kagoshima AB et Iriomote AB (voir figure 3.3). Il faut toutefois garder à l’esprit que les différentiels d’expression mis en évidence par ces approches ne s’expliquent pas forcément par la coévolution avec Wolbachia, puisque les lignées Iriomote et Kagoshima ont vraisemblablement divergées également par dérive génétique et / ou adaptation à des aspects de leurs environnements respectifs indépendants de la présence de Wolbachia. Quoi qu’il en soit, ces trois approches aboutissent à des résultats similaires, et seuls ceux qui ont été obtenus avec la dernière d’entre elles seront détaillés dans ce qui suit. Dans l’ensemble des gènes surexprimés chez Kagoshima AB (relativement à Iriomote AB), goseq identifie les 4 mêmes termes GO que dans l’ensemble des gènes surexprimés en absence de Wolbachia :

structural constituent of ribosome, translation, ribosome biogenesis, et ribosome. 69 gènes

codant pour des protéines ribosomales sont significativement surexprimés chez les Kagoshima AB relativement aux Iriomote AB, parmi lesquels les 16 évoquées plus haut (surexprimées chez les Kagoshima AB relativement aux Kagoshima NT).

L’analyse des transcriptomes ovariens d’A. japonica révèle donc un parallèle entre l’effet proximal et l’effet ultime de Wolbachia. Une explication possible serait que la surexpression de gènes impliqués dans la traduction observée chez la souche naturellement infectée (Kagoshima) relativement à la souche non infectée (Iriomote) constitue une adaptation compensatoire à la présence de wAjap. Cette dernière aurait eu à l’origine un effet inhibiteur sur la traduction des gènes de son hôte – un effet toujours détectable lorsque l’on compare Kagoshima AB et Kagoshima NT – qui a dû être compensé par l’adaptation génétique de celui-ci.

Les analyses fonctionnelles n’ont pas permis de mettre en évidence des fonctions affectées par Wolbachia – tant d’un point de vue proximal qu’ultime – autres que la traduction. On peut craindre que ce résultat soit un artefact dû au fait que l’analyse différentielle a été réalisée sur un nombre réduit de gènes, du fait du clustering effectué par Silix. Il serait donc intéressant de réaliser des analyses différentielles et fonctionnelles de l’effet de l’antibiotique au sein de chacune des deux lignées (sur l’ensemble des gènes présents dans chacun des transcriptomes) et / ou d’avoir recours à une méthode moins stringente (i.e., qui conserverait un plus grand nombre de gènes) d’identification des orthologues afin de réaliser les comparaisons entre lignées.

3.3. Effet de Wolbachia sur le transcriptome ovarien d’A. tabida et

comparaison avec A. japonica

a) Obtention et pré-analyse des transcriptomes ovariens d’A. tabida Elevage, traitement antibiotique, dissections et extraction des ARN totaux

L’élevage des A. tabida, les traitements antibiotiques, les dissections et l’extraction des ARN totaux ont été réalisés de la même façon que pour A. japonica (voir section 3.2.a).

Séquençage

Les banques d’ADNc ont été préparées à l’aide des kits SMARTer PCR cDNA synthesis et BD Advantage 2 PCR (Clontech) et purifiées à l’aide du kit Qiaquick (Qiagen). Le séquençage a été réalisé par le Genoscope (Evry, France) sur un appareil Illumina GA-IIx. Le séquençage a été réalisé en single-read (lectures de 76 paires de bases). La couverture moyenne était de 19 millions de lectures par échantillon.

Assemblage, clustering et comptage

Tandis que les lignées d’A. japonica Iriomote et Kagoshima sont issues de populations géographiquement séparées, les lignées d’A. tabida SFR2 et SFR3 ont été piégées à Sainte Foy-Lès-Lyon (69). En conséquence, on ne s’attend pas à ce que ces dernières aient fortement divergé, raison pour laquelle un seul assemblage de transcriptome – commun aux deux lignées – a été réalisé (tableau 3.4).

Assemblage Nombre de gènes N50 % de gènes annotés en BLASTX

SFR2 & SFR 3 26074 1621 57 Tableau 3.4. Assemblages du transcriptome ovarien d’A. tabida.

b) Analyse différentielle

L’analyse différentielle a été réalisée de la même façon que pour les transcriptomes d’A.

japonica, à ceci près que les données n’ont été normalisées que par leur couverture. Après

élimination des transcrits à faible comptage (moins de 10 en moyenne sur les 8 échantillons), 16038 (sur les 26074 issus de l’assemblage) ont été conservés pour l’analyse.

Tandis que les phénotypes ovariens des lignées SFR2 et SFR3 sont très différents lorsqu’elles sont traitées aux antibiotiques – SFR2 étant caractérisée par l’absence d’œufs –, ils ne sont pas distinguables en absence de traitement. Les différences transcriptomiques reflètent ces différences phénotypiques (voir figure 3.5). Ainsi, en condition de traitement aux antibiotiques, 25,4 % (4079/16038) des transcrits étaient surexprimés, et 23,1 % (3702) sous-exprimés, chez SFR3 relativement à SFR2. En revanche, en absence de traitement, seulement 4,5% (729) des transcrits étaient surexprimés, et 4,6 % (733) sous-exprimés, chez SFR3 relativement à SFR2. Toujours en accord avec les données phénotypiques, l’effet de l’antibiotique sur l’expression était bien plus important chez SFR2 que chez SFR3. Ainsi, au sein de la lignée SFR2 – chez qui aucun œuf n’est produit en absence de Wolbachia –, 18,7 % (2998) des transcrits étaient surexprimés, et 23,7 % (3800) sous-exprimés, sous l’effet du traitement antibiotique. Chez SFR3 – où la production d’œufs n’est réduite que de moitié environ en absence de Wolbachia –, seulement 0,5 % (81) des transcrits étaient surexprimés, et 1,5 % (240) sous-exprimés, sous l’effet du traitement antibiotique. Parmi les 321 gènes différentiellement exprimés sous l’effet du traitement antibiotique chez SFR3, une majorité (240) l’est également chez SFR2 (figure 3.6). D’un point de vue transcriptomique, la différenciation est nettement plus marquée entre SFR2 NT et SFR 3 NT – qui ont pourtant des phénotypes ovariens similaires – qu’entre SFR 3 NT et SFR3 AB – qui ont des phénotypes ovariens distincts. Ce résultat est d’autant plus surprenant que SFR2 et SFR3 ont la même origine géographique.

Figure 3.5. Analyse différentielle des transcriptomes ovariens d’A. tabida, avec indication du pourcentage de gènes surexprimés (en rouge) et sous-exprimés (en bleu) dans la modalité vers laquelle pointe la flèche par rapport à la modalité d’où part la flèche.

Figure 3.6. Diagramme de Venn des gènes différentiellement exprimés (dans le même sens) dans les différentes comparaisons de l’analyse des transcriptomes ovariens d’A. tabida (SFR3 : lignée produisant des œufs en condition aposymbiotique ; SFR2 : lignée ne produisant pas d’œufs en condition aposymbiotique ; AB : traitement antibiotique ; NT : pas de traitement).

L’analyse en composante principale (ACP) des données de comptage confirme les résultats de l’analyse différentielle : le premier axe, qui explique 72 % de la variance totale, sépare nettement les échantillons selon leur lignée, tandis que le deuxième axe, qui explique 21 % de la variance totale, sépare nettement les échantillons de la lignée SFR2 selon leur modalité de traitement, et, dans une bien moindre mesure, ceux de la lignée SFR3 (voir figure 3.7).

Figure 3.7. ACP sur les données des transcriptomes ovariens d’A. tabida. AB : traitement antibiotique, NT : pas de traitement.

c) Comparaison entre A. tabida et A. japonica

Dans l’optique de comparer les effets de l’élimination de Wolbachia chez A. tabida et

A. japonica, nous avons recherché, à l’aide de goseq, les termes GO enrichis parmi les gènes

différentiellement exprimés sous l’effet de l’antibiotique. Comme nous l’avons vu dans la section 3.1, l’ensemble des gènes différentiellement exprimés entre les A. tabida symbiotiques et les A. tabida aposymbiotiques est susceptible d’inclure des gènes dont l’expression différentielle est une conséquence, plutôt qu’une cause, de la dépendance. On peut s’attendre à ce que ce soit particulièrement le cas des gènes différentiellement exprimés entre SFR2 NT et SFR2 AB, du fait du phénotype de dépendance extrême observé chez cette lignée (i.e., l’absence d’œufs). C’est pourquoi nous nous sommes focalisés sur l’étude de la lignée SFR3 dans ce qui suit. Le phénotype de dépendance de cette lignée étant moins marqué – puisqu’un certain développement ovarien a lieu chez les femelles aposymbiotiques –, le nombre de gènes différentiellement exprimé du fait des conséquences de la dépendance sera vraisemblablement inférieur à ce qui est le cas chez SFR2. Par ailleurs, les gènes différentiellement exprimés entre SFR2 AB et SFR2 NT sont également en cours d’analyse, et confirment les résultats

précédemment obtenus (Kremer et al. 2012), notamment en ce qui concerne l’importance de l’homéostasie oxydative (Fabrice Vavre, comm. pers.).

Chez SFR3, l’analyse goseq n’identifie aucun terme GO significativement enrichi, que ce soit parmi les gènes surexprimés ou parmi les gènes sous-exprimés en absence de Wolbachia. La comparaison des deux modèles biologiques a donc été effectuée au niveau des gènes plutôt que des catégories fonctionnelles, ce qui a nécessité l’identification des orthologues par le biais de Silix. Parmi les 81 gènes surexprimés sous l’effet de l’antibiotique chez SFR3, seuls 6 ont un orthologue parmi les 1891 gènes retenus pour l’analyse des transcriptomes ovariens d’A. japonica. Aucun des 6 n’est présent parmi les 56 surexprimés sous l’effet de l’antibiotique chez Kagoshima. Parmi les 240 gènes sous-exprimés sous l’effet de l’antibiotique chez SFR3, seuls 15 ont un orthologue parmi les 1891 gènes retenus pour l’analyse des transcriptomes ovariens d’A. japonica. Un seul de ces 15 gènes est également présent parmi les 59 gènes sous-exprimés sous l’effet de l’antibiotique chez Kagoshima. Celui-ci code pour une bifunctional

3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate synthase (PAPPS), une enzyme nécessaire à la

sulfonation. Cette réaction étant impliquée dans de très nombreux processus biologiques, tels que l’activité hormonale et le développement du système nerveux (Dejima et al. 2006), il est difficile d’interpréter la relation entre la présence de Wolbachia et l’expression du gène codant pour la PAPPS. On peut toutefois noter que le rôle de la sulfonation a déjà été mis en évidence dans le contexte de la symbiose. Dans le cas de l’association entre la bactérie fixatrice d’azote

Sinorhizobium meliloti et la luzerne Medicago sativa, la sulfonation des lipopolysaccharides jouant le rôle de facteurs de nodulation est en effet nécessaire à l’établissement de la symbiose