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II. Le genre Staphylococcus

II.6. Comportement de S. aureus dans des produits laitiers

II.6.2. Comportement de Staphylococcus aureus dans les fromages et

3. Effet des souches de Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis et Enterococcus

2.7. Dénombrement des Staphylococcus à coagulase positive

Les Staphylococcus à coagulase positive ont été dénombrés dans les laits ensemencés ou les fromages après 0, 3, 6 et 24 h d'incubation ou de fabrication comme décrit dans le paragraphe 1.6. Les laits ont été analysés avant et après broyage de 4 min au Stomacher.

2.8. Mesure du pH

Les pH des laits ont été enregistrés en continu grâce au logiciel CINAC (YSEBAERT, Frepillon- France), les pH des fromages de toutes les fabrications décrites ont été mesurés avec un pH-mètre 926 VTV muni d’une électrode Ingold 406 MX (Mettler-Toledo S.A., Viroflay-France).

2.9. Analyse statistique

Les données sur l'effet du broyage et l'effet de la présure à 0, 3, 6 et 24 h d'incubation ont été statistiquement analysées par Analyse de Variance ANOVA (ANalysis Of

Variance). Lorsque les moyennes étaient significativement différentes, un test de

Newman-Keuls a été réalisé par le logiciel Statistica (StatSoft 2003, version 6.1, Tulsa, USA).

3. Effet des souches de Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis et

Enterococcus faecalis sur le comportement de Staphylococcus aureus.

"Les résultats correspondant à cette partie seront présentés dans le chapitre 2 de la partie résultats".

La souche de S. aureus SA15 (cf origine dans le tableau 14) a été cultivée en présence de différentes souches de bactéries lactiques en lait microfiltré ou en milieu Trypticase-Soja sans sucre (TS) tamponné à pH 6,8 (cf. composition du milieu en annexe 2). Le lait entier microfiltré (lait épuré en microorganismes) (Marguerite, Villefranche sur Saône, ARNAS, France) a été choisi sur la base de sa faible contamination microbienne et de la croissance importante de S. aureus SA15 dans ce lait.

3.1. Effet du pH initial du lait sur la croissance de S. aureus SA15

Un ml de culture décongelée de S. aureus a été inoculé dans 9 ml de bouillon BHI modifié avec 12 g/l de lait en poudre (Lactalis industry, Bourgbarré, France). Après 18 h d'incubation à 37°C, l'inoculum de S. aureus a été préparé comme décrit dans le paragraphe 3.2.2.

La souche S. aureus SA15 a été ensemencée à 150 ufc/ml dans du lait microfiltré préalablement ajusté à différents pH 6,50; 6,25; 6,00; 5,78 et 5,60 avec de l'acide lactique à 90% (Prolabo, Lyon, France). Les cultures ont été incubées à 33°C pendant 24 h.

3.2. Co-cultures de S. aureus SA15 avec Lactococcus et Enterococcus en lait microfiltré

3.2.1. Choix des souches de bactérie lactique

Quatre souches de Lactococcus garvieae (N201, Tan 1, Tan 2 et 1204), 3 souches de

Lactococcus lactis subsp. lactis (N650, N658 et N688) et une souche d'Enterococcus

faecalis N516 ont été testées en co-culture avec S. aureus SA15 (cf. Origine de souches dans le tableau 14). Les souches de bactérie lactique ont été identifiées par séquençage de l'ADNr 16S selon la méthode décrite par Callon et al, (2004) et leur diversité génomique a été évaluée par REP-PCR (Jersek et al. 1999). Les souches N650, N658, N688 et N516 ont été sélectionnées pour leur capacité inhibitrice mise en évidence dans une étude antérieure (Florentin, 2000).

3.2.2. Co-culture de S. aureus et des souches de bactérie lactique Un ml de culture décongelée de chaque souche (cf 3.2.1) a été inoculé dans 9 ml de bouillon M17 (Biokar). La culture a été incubée à 30°C pendant 18 h. Un ml de cette culture a été inoculé dans 9 ml de lait écrémé reconstitué (Lactalis industry, Bourgbarré, France). Après 18 h d'incubation à 30°C, la culture de bactérie lactique a été inoculée dans du lait microfiltré (5 % v/v). Le lait microfiltré avait été préalablement ensemencé à 150 ufc/ml de S. aureus SA15 préparée comme il est décrit dans le paragraphe 3.1.

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3.2.3. Effets des acides aminés sur l'inhibition de S. aureus SA15 par L. garvieae N201

Les acides aminés méthionine, thréonine, phénylalanine, isoleucine et valine (MERCK, Darmstadt, Germany) ont été préparés en eau distillée et stérilisés par filtration sur filtre de cellulose de 0,45 µm de porosité (Minisart, Sartorius AG, Germany). Ils ont été ajoutés à une concentration de 10 µmol/l dans du lait microfiltré (Marguerite, Villefranche sur Saône, ARNAS, France) inoculé par S. aureus et L.

garvieae comme décrit dans le paragraphe 3.2.2.

3.3. Co-cultures de S. aureus SA15 avec L. garvieae N201, L. lactis N658 ou E.

faecalis N516 en milieu tamponné

Les souches, L. garvieae (N201), L. lactis subsp. lactis (N658), et E. faecalis (N516) ont été cultivées en bouillon M17 (Biokar) pendant 18 h à 30 °C, puis les cultures ont été centrifugées à 9600 x g pendant 15 min à 4 °C. Les cellules bactériennes ont été lavées une fois dans la solution de Ringer, puis remises en suspension dans la solution de Ringer. Elles ont été ensemencées en milieu TS tamponné préalablement inoculé avec S. aureus SA15 à 150 ufc/ml pour obtenir une concentration initiale de 108 ufc/ml. Des essais préalables avaient permis de quantifier les niveaux de population des cultures bactériennes avant l'ensemencement.

3.4. Conditions d'incubation et prélèvement

Les cultures en lait microfiltré ou en milieu TS tamponné ont été incubées en Bain-Marie thermostaté comme il est indiqué dans le paragraphe 3.2.5. Des prélèvements ont été effectués à 0, 3, 6 et 24 h pour des analyses microbiologiques et biochimiques. Le pH a été enregistré en continu grâce au logiciel CINAC (YSEBAERT, Frepillon- France).

3.5. Dénombrement des microorganismes

Tous les échantillons de lait microfiltré ou de milieu tamponné ont été broyés pendant 4 min au stomacher (MIX 1, AES Laboratoire, Combourg - France). Les bactéries lactiques ont été dénombrées sur milieu M17 (Biokar diagnostic, Pantin, France) incubé pendant 48 h à 30°C. S. aureus SA15 a été dénombrée selon la norme ISO

6888-2 (cf 1.6). Les résultats des dénombrements microbiens ont été exprimés en Unité Formant Colonie (UFC) par ml de lait ou de milieu. Les valeurs ont ensuite été converties en logarithme décimal.

3.6. Analyses biochimiques

Des échantillons de lait microfiltré ont été stockés au congélateur à - 20°C pour les analyses biochimiques.

3.6.1. Dosage de lactose, acide lactique et acide acétique

Les concentrations en lactose, galactose, acide acétique et acide lactique dans le lait microfiltré ont été déterminées à l'aide de kits enzymatiques (ENZYPlus, Diffchamb, Lyon, France) selon le protocole préconisé par le fournisseur.

3.6.2. Dosage des acides aminés

Ces travaux ont été effectués en collaboration avec le Laboratoire Biotechnologie - Bioprocédés, INSA, Toulouse.

Les acides aminés libres du milieu ont été analysés dans les surnageants de culture après précipitation pour éviter les interférences dans les dosages. Les protéines ont été précipitées par l'ajout de quatre volumes de méthanol pour un volume de surnageant. Après une nuit dans de la glace, le mélange a été centrifugé. Le surnageant a été utilisé pour les dosages.

Les acides aminés libres du milieu de fermentation ont été dosés par un AminoQuant HP 1090, qui est une chromatographie à haute pression avec un compartiment de dérivatisation et d’injection thermostaté, contrôlé par micro-ordinateur. Les acides aminés sont dérivés de façon automatique par l’aldéhyde ortho-phtalique (OPA) et le 9-fluorenylméthyl-chloroformiate (FMOC-Cl). Le premier composé réagit avec les substances comportant une fonction amine primaire en présence d’un composé thiolique (acide 3-mercaptopropionique), le second acyle ensuite les acides aminés secondaires (la proline).

La séparation des substances dérivées se fait selon l’hydrophobicité des complexes formés par passage sur une colonne Hypersil C18 à 35°C, par un gradient binaire de

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tampon acétate (pH 7,2) - EDTA-triéthyl amine-tétrahydrofuranne et tampon acétate (pH 7,2) -méthanol-acétonitrile.

Deux détecteurs sont utilisés en parallèle, un spectrophotomètre à barrettes de diode, réglé à 338 nm pour les dérivés OPA, et 262 nm pour les dérivés FMOC, mesurant des concentrations entre 100 et 1000 µM, et un spectrofluorimètre, réglé à 340/450 nm pour les dérivés OPA, et 266/305 nm pour les dérivés FMOC, mesurant des concentrations entre 10 et 100 µM.

Pour les analyses en milieu lait, en raison de leur faible concentration, tous les acides aminés excepté la proline ont été quantifiés par spectrofluorimétrie. La proline a été quantifiée par spectrophotométrie car les résultats étaient incohérents.

3.7. Recherche des substrats inhibiteurs dans les surnageants de culture

La technique de WDAT (Well Diffusion Agar Test) décrite par Hernandez et al, (2005) a été utilisée.

La souche S. aureus SA15 a été inoculée dans 10 ml de bouillon BHI avec 1% de gélose pour avoir une concentration finale de S. aureus de 105 UFC ml-1. La gélose contenant S. aureus a été coulée à la surface d'un milieu gélosé M17. Après 30 min à 4°C, des puits de 6 mm ont été creusés dans les deux couches de gélose. Les puits ont été remplis avec des surnageants concentrés selon la méthode décrite par Hernandez et al, (2005) par centrifugation sur des membranes de seuil de coupure de 3000 Daltons (Vivascience, Hannover, Allemagne). Les surnageants testés provenaient de co-cultures de L. garvieae N201, L. lactis N658 et E. faecalis N516 avec S. aureus en milieu TS tamponné.

Après 1 h à 4°C, les boîtes ont été incubées à 30°C pendant 24 h. Après l'incubation, les zones d'inhibition autour des puits ont été observées.

3.8. Analyse statistique

Les résultats des différentes variables (niveaux de S. aureus, pH, concentration en acides aminés, concentrations en L-lactate et acétate) ont été statistiquement analysés par Analyse de Variance ANOVA. Lorsque les moyennes étaient significativement différentes, un test de Newman-Keuls a été réalisé comme il est décrit dans le paragraphe 1.8.

Tableau 15: Composition des différents milieux étudiés pour la croissance de S. aureus.

N° de milieu Nom donné Composition /l de milieu 1 lait Lait microfiltré

2 MB* Tryptone 17g, Peptone pancréatique de caséine 3 g, Extrait de levure 6 g

3 MB 1 Tryptone 17 g, Peptone pancréatique de caséine 3 g, Extrait de levure 6 g, poudre du lait 12 g 4 MB 2 Tryptone 17 g, Peptone pancréatique de caséine 3 g, Extrait de levure 6 g, poudre du lait 6 g 5 MB 3 Tryptone 17 g, Peptone pancréatique de caséine 3 g, Extrait de levure 6 g, poudre du lait 1,2 g 6 TPYC Tryptone 17 g, Peptone pancréatique de caséine 3 g, Extrait de levure 6 g, Caséine 15 g

7 TPYC+ Cr Tryptone 17 g, Peptone pancréatique de caséine 3 g, Extrait de levure 6 g, Caséine 15 g, Crème UHT 30 ml

8 CCr Caséine 40 g, Crème UHT 30 ml MB= milieu de base

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