Ecologie chimique de la dépendance d’Asobara japonica

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Chapitre 4 : Dépendance d’Asobara japonica à Wolbachia pour la production de femelles

4.3. Ecologie chimique de la dépendance d’Asobara japonica

a) Introduction

En plus de confirmer que les femelles thélytoques sont moins attractives que les femelles arrhénotoques vierges, Ma et al. (2014) montrent que l’attractivité des femelles issues de populations thélytoques dépend de leur statut d’infection. Le pourcentage de femelles induisant le comportement de cour passant de 8 (3/40) chez les infectées à 55 (11/20) chez celles ayant reçu un traitement antibiotique. Les femelles thélytoques non infectées sont donc plus attractives que les femelles thélytoques infectées, tout en restant moins attractives que les femelles arrhénotoques, qui induisent le comportement de cour des mâles dans 88 % (43/49) des cas. Ces résultats suggèrent d’une part que la production de phéromones a évolué au sein des populations thélytoques, et d’autre part que Wolbachia interfère directement avec la production de phéromones. Un tel effet direct du microbiote sur les phéromones de l’hôte a déjà été montré (Sharon et al 2010) et dans au moins un cas, cet effet a été attribué à Wolbachia (Koukou et al. 2006 mais voir aussi Sharon et al. 2010).

Afin d’étudier les effets proximaux et ultimes de Wolbachia sur l’attractivité des femelles thélytoques, nous nous sommes intéressés aux hydrocarbures cuticulaires d’A.

japonica, des molécules qui jouent notamment le rôle de phéromones sexuelles.

b) Matériel et méthodes

Les hydrocarbures cuticulaires ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS). Trois lots d’échantillons ont été analysés (voir tableau 4.9 dessous). A l’exception de ceux présentés dans la section f), tous les résultats discutés ci-dessous correspondent au lot 3, le plus complet puisqu’il est le seul à inclure des individus traités aux antibiotiques. Cependant, lorsque les analyses effectuées avec les échantillons du lot 3 peuvent être réalisées avec ceux du lot 2, les résultats obtenus sont similaires dans les deux cas.

Lots Lignée Sexe et statut d'accouplement Traitement Réplicats

Lot 1 (janvier 2013)

Iriomote Mâles NT 8

Iriomote Femelles vierges NT 8

Iriomote Femelles accouplées NT 8

Kagoshima Femelles NT 8

Lot 2 (été 2013)

Iriomote Femelles vierges NT 6

Iriomote Femelles accouplées NT 6

Kagoshima Femelles NT 6 Sendaï Femelles NT 6 Tokyo Femelles NT 6 Lot 3 (été 2015) Iriomote Mâles NT 8 Iriomote Mâles NT 8 Kagoshima Mâles NT 3 Tokyo Mâles NT 6

Iriomote Femelles vierges NT 7

Iriomote Femelles accouplées NT 8

Kagoshima Femelles NT 8

Tokyo Femelles NT 7

Iriomote Mâles AB 8

Iriomote Femelles vierges AB 6

Iriomote Femelles accouplées AB 6

Kagoshima Femelles AB 8

Tokyo Femelles AB 8

Tableau 4.9. Echantillons passés en GC-MS. Les lignées Kagoshima, Sendaï et Tokyo sont thélytoques. La lignée Iriomote est arrhénotoque. NT : pas de traitement antibiotique, AB : traitement antibiotique.

Elevage des insectes

Les insectes utilisés pour l’analyse des hydrocarbures se sont développés dans les mêmes conditions que ceux utilisés pour l’analyse transcriptomique (section 4.2.b).

Extraction des échantillons

Chaque échantillon était constitué de quatre individus extraits dans 100 µL d’hexane. 0,5 µg d’octadécane ont été ajoutés à chaque échantillon en guise d’étalon interne permettant la quantification absolue des hydrocarbures. Les insectes ont été retirés de l’hexane après 10 min d’incubation à température ambiante.

Chromatographie en phase gazeuse, spectrométrie de masse

La chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse ont été réalisées par Martin Kaltenpoth et Tobias Engl (Max Planck Institute for Chemical Ecology). Les extraits ont été évaporés jusqu’à ne contenir plus que 15-20 µL d’hexane sous un flux constant d’argon et transférés dans des tubes pour chromatographie en phase gazeuse de 150 µL (CZT, Kriftel, Germany). Pour chaque échantillon, un aliquot de 1 µL a été injecté dans un chromatographe en phase gazeuse Varian 450GC couplé à un spectromètre de masse Varian 240MS (Agilent Technologies, Böblingen, Germany) au moyen d’un injecteur split/splitless (avec/sans diviseur de flux) à 250 °C, avec la valve de purge ouverte après 60 s. Le chromatographe était équipé d’une colonne capillaire DB5-MS (30 m x 0,25 mm de diamètre, épaisseur du film : 0,25 µm, Agilent Technologies) et programmé de 150 à 300 °C à 5 °C/min avec 1 min d’isotherme initial et 32 min d’isotherme final. L’hélium a été utilisé comme gaz porteur, avec un flux constant de 1 mL/min. Les spectres de masse ont été enregistrés par ionisation électronique (EI-MS). L’acquisition des données et les quantifications ont été effectuées à l’aide du logiciel MS Workstation Version 6.9.3 (Agilent Technologies). Les pics ont été identifiés par leur spectre de masse, et les aires des pics ont été automatiquement intégrées à l’aide du logiciel MS Workstation Software. Finalement, le succès de cette intégration a été contrôlé manuellement pour chaque pic. Certaines substances ont été combinées dans l’analyse, car les pics ne sont pas toujours clairement séparés sur les chromatogrammes.

Analyses statistiques

Les quantités relatives de chaque composé ont été calculées à partir des aires des pics, et transformées suivant Aitchison (1986). Afin de déterminer si les profils chimiques des différentes modalités étaient différenciés, deux procédures différentes ont été utilisées : une analyse de regroupement hiérarchique et une analyse en composante principale normée suivie d’une analyse discriminante linéaire. L’analyse de regroupement hiérarchique permet d’évaluer le regroupement des échantillons sans assignation à priori de ceux-ci à des groupes. L’analyse en composante principale est utilisée afin de réduire le nombre de variables. Les composantes principales extraites (valeurs propres > 1) sont utilisées pour réaliser une analyse discriminante permettant de tester les différences entre modalités avec assignation à priori des échantillons. Toutes les analyses ont été réalisées à l’aide du logiciel SPSS, version 17.0.

c) Différenciation des profils d’hydrocarbures

L’analyse de regroupement hiérarchique (figure 4.5) distingue clairement les femelles arrhénotoques des thélytoques, mais pas les différentes modalités au sein de ces deux groupes. L’analyse discriminante (figure 4.6), réalisée sur 4 composantes principales expliquant 84,1 % de la variance, montre également une claire différenciation des femelles arrhénotoques et thélytoques (Lambda de Wilks = 0.007 ; χ²28 = 203,5 ; p < 0,001). L’analyse discriminante réalisée sur l’ensemble des femelles thélytoques (5 composantes principales expliquant 87,2 % de la variance) sépare significativement les femelles issues de Kagoshima et Tokyo (Lambda de Wilks = 0.302 ; χ²5 = 25,7 ; p < 0,001), mais pas les femelles infectées par Wolbachia de celles traitées aux antibiotiques (figure 4.7). L’analyse discriminante réalisée sur les femelles arrhénotoques (4 composantes principales expliquant 83 % de la variance) ne sépare pas significativement les différentes modalités (Lambda de Wilks = 0.408 ; χ²12 = 15,2 ; p = 0,228 ; figure 4.8), que ce soit par le statut d’accouplement (femelles accouplées ou vierges) ou le traitement (femelles traitées aux antibiotiques ou non).

Figure 4.5. Analyse de groupement hiérarchique sur les profils d’hydrocarbures cuticulaires des femelles

A. japonica (Lignées thélytoques : Kagoshima et Tokyo, lignée arrhénotoque : Iriomote, NT : non traitées, AB

Figure 4.6. Projection dans le plan défini par les composantes 1 et 2 des résultats de l’analyse discriminante réalisée sur les 4 premières composantes de l’analyse en composante principale des profils d’hydrocarbures des femelles A. japonica (lignées thélytoques : Kagoshima et Tokyo, lignée arrhénotoque : Iriomote, NT : non traitées, AB : traitées aux antibiotiques, V : vierges, A : accouplées).

Figure 4.7. Projection dans le plan défini par les composantes 1 et 2 des résultats de l’analyse discriminante réalisée sur les 5 premières composantes principales de l’analyse en composante principale des profils d’hydrocarbures des femelles A. japonica thélytoques (NT : non traitées, AB : traitées aux antibiotiques).

Figure 4.8. Projection dans le plan défini par les composantes 1 et 2 des résultats de l’analyse discriminante réalisée sur les 4 premières composantes principales de l’analyse en composante principale des profils d’hydrocarbures des femelles A. japonica arrhénotoques (NT : non traitées, AB : traitées aux antibiotiques, V : vierges, A : accouplées).

En ce qui concerne les mâles, l’analyse de regroupement hiérarchique (figure 4.9) ne distingue aucune des modalités. En revanche, l’analyse discriminante (5 composantes principales expliquant 88,9 % de la variance) sépare significativement les trois populations : Iriomote, Kagoshima et Tokyo (Lambda de Wilks = 0.089 ; χ²10 = 53,3 ; p < 0,001 ; figure 4.10).

Figure 4.9. Analyse de groupement hiérarchique sur les profils d’hydrocarbures cuticulaires des mâles

A. japonica (lignées thélytoques : Kagoshima et Tokyo, lignée arrhénotoque : Iriomote, NT : non traitées, AB :

Figure 4.10. Projection dans le plan défini par les composantes 1 et 2 des résultats de l’analyse discriminante réalisée sur les 5 premières composantes principales de l’analyse en composante principale des profils d’hydrocarbures des mâles A. japonica (lignées thélytoques : Kagoshima et Tokyo, lignée arrhénotoque : Iriomote, NT : non traitées, AB : traitées aux antibiotiques).

d) Effet proximal de Wolbachia

Comme nous l’avons vu, les observations comportementales rapportées par Ma et al. (2014) permettent de prédire un effet proximal de Wolbachia sur les phéromones produites par

A. japonica. Or, aucune différence significative entre les profils d’hydrocarbures cuticulaires

des femelles thélytoques traitées aux antibiotiques et celui des non traitées n’a pu être mise en évidence. Nous ne pouvons donc confirmer l’effet proximal de Wolbachia sur la production de phéromones de son hôte. Il se peut que Wolbachia ait un impact sur des phéromones qui ne soient pas des hydrocarbures, et donc absents de nos extraits à l’hexane. Chez A. tabida, outre les hydrocarbures, le méthyl 6-méthylsalicitate, ainsi que des acétates alcooliques gras, jouent un rôle dans le déclenchement du comportement de cour des mâles (Stökl et al. 2014). Afin d’extraire ces composés, les auteurs ont utilisé du dichlorométhane plutôt que de l’hexane. Les tests comportementaux – de l’extrait complet, mais aussi de fractions de celui-ci – qu’ils ont

réalisés ont permis de montrer que les hydrocarbures seuls déclenchent une réponse chez le mâle, mais moins marquée que lorsque les autres composants sont également présents (les hydrocarbures seuls déclenchent significativement plus de wing fanning – un comportement de cour des mâles – que le solvant seul, mais significativement moins que l’extrait complet). Une étude de l’ensemble des phéromones potentielles d’A. japonica, non restreinte aux hydrocarbures cuticulaires, permettraient donc peut-être de mettre en évidence un effet proximal de Wolbachia.

e) Effet ultime de Wolbachia

Malgré l’absence d’effet proximal de Wolbachia, nos données révèlent une forte différenciation des profils d’hydrocarbures cuticulaires entre femelles arrhénotoques et thélytoques. Du point de vue de la production de phéromones sexuelles, les pressions de sélection s’exerçant sur les femelles arrhénotoques sont très différentes de celles s’exerçant sur les femelles thélytoques. Cela pourrait expliquer la différenciation observée. Cependant, cette dernière pourrait s’expliquer par des facteurs indépendants du mode de reproduction – donc indépendamment de l’infection par Wolbachia.

En effet, les populations arrhénotoques et thélytoques étant séparées géographiquement, la différenciation de leurs profils d’hydrocarbures cuticulaires pourrait résulter de processus démographiques aléatoires ou de l’adaptation à des conditions environnementales différentes. En particulier, cette différenciation pourrait s’expliquer par l’adaptation à des conditions climatiques différentes, étant donné que les hydrocarbures cuticulaires sont impliqués dans la protection contre la dessiccation (Foley & Telonis-Scott 2011) et que les populations thélytoques occupent des latitudes plus élevées que les arrhénotoques. Les variations des profils d’hydrocarbures cuticulaires le long d’un cline latitudinal ont notamment été étudiées chez deux espèces de drosophiles, D. melanogaster et D. serrata (Frentiu & Chenoweth 2010). Dans les deux cas, l’expression d’hydrocarbures à courte chaîne carbonée augmente avec la latitude, tandis que les hydrocarbures à longue chaîne carbonée montrent le patron inverse. Ce résultat suggère que la différenciation des hydrocarbures chez ces espèces résulte plutôt de l’adaptation à l’environnement abiotique local qu’à la sélection sexuelle agissant sur les phéromones. Une telle explication ne serait toutefois pas pleinement convaincante dans le cas d’A. japonica, puisque le patron de différenciation est dichotomique (les deux populations thélytoques d’une part et les deux populations arrhénotoques d’autre part). Sous l’hypothèse selon laquelle la latitude est le facteur crucial expliquant les profils d’hydrocarbures cuticulaires, on s’attendrait

plutôt à ce que les profils d’Amami et Kagoshima occupent des positions intermédiaires entre Iriomote et Tokyo (voir figure 4.1).

Dans quelle mesure l’infection par Wolbachia explique-t-elle la différenciation entre femelles thélytoques et arrhénotoques chez A. japonica ? De ce point de vue, deux de nos résultats sont potentiellement pertinents, sans toutefois être concluants.

Premièrement, on s’attend à ce que l’effet ultime de Wolbachia ne concerne que les phéromones sexuelles, et pas l’ensemble des hydrocarbures cuticulaires. Or, l’absence de différenciation entre les femelles arrhénotoques vierge et accouplées suggère que les molécules attractives ne constituent qu’une infime partie des hydrocarbures cuticulaires, et donc que la différenciation entre femelles thélytoques et arrhénotoques est trop globale pour être expliquée uniquement – ou même majoritairement – par Wolbachia. Il faut toutefois noter qu’il n’a pas été vérifié que les femelles Iriomote accouplées sont moins attractives que les vierges, et que cela est mis en doute par les résultats transcriptomiques présentés plus haut.

Deuxièmement, sous l’hypothèse que la différenciation des profils cuticulaires entre les populations arrhénotoques et thélytoques est un effet ultime de Wolbachia sur la synthèse des phéromones sexuelles, on peut s’attendre à ce que cette différenciation soit plus marquée chez les femelles que chez les mâles. En effet, sous les hypothèses des traits coûteux femelles et de la virginité fonctionnelle, la synthèse des phéromones sexuelles femelles sera soumise à des pressions de sélection divergentes dans les deux types de populations et évoluera donc rapidement. En revanche, comme les mâles thélytoques ne sont pas directement sous sélection, seule la dérive pourra entrainer une différenciation au niveau des phéromones sexuelles mâles (sauf en cas de pléiotropie, i.e., si les gènes impliqués dans la synthèse des phéromones sexuelles mâles sont sous sélection chez les femelles). Comme nous l’avons vu, l’analyse de regroupement hiérarchique et l’analyse discriminante donnent des résultats contradictoires : seule la seconde sépare les mâles thélytoques des mâles arrhénotoques.

En conséquence, nos données ne permettent pas de conclure quant à l’effet ultime de

Wolbachia sur les hydrocarbures cuticulaires chez A. japonica.

f) Composés femelles-spécifiques

L’identification des composés des échantillons du lot 1 a permis de mettre en évidence la présence de deux esters spécifiques des femelles, donc particulièrement susceptibles de jouer un rôle dans l’attraction des mâles. En raison de leur faible quantité dans les échantillons, ils

n’ont pu être identifiés plus précisément, et seront nommés ester 1 et ester 2 par la suite. Ces deux esters ne sont pas trouvés en quantités différentes, mais le ratio ester 2 / ester 1 est supérieur chez les femelles arrhénotoques vierges, relativement aux autres modalités. Ainsi, les femelles thélytoques vierges présentent un ratio similaire à celui des arrhénotoques accouplées (figure 4.11). Ces résultats correspondent aux échantillons du lot 2, mais n’ont pu être répliqués avec ceux du lot 3. En effet, les esters 1 et 2 n’ont pu être détectés dans les échantillons du lot 3, possiblement parce qu’ils ont été dégradés en raison d’une température ambiante trop élevée lors du passage en GC-MS. Une électroantennographie permettrait de vérifier que ces esters sont perçus par les mâles, mais la validation du rôle de ces esters dans le déclenchement du comportement de cour ne pourrait être effectuée que par le biais de tests comportementaux, semblables à ceux réalisés par Stökl et al. (2014) chez A. tabida. L’hexane contenant l’ensemble des hydrocarbures cuticulaires des femelles était déposé sur un leurre (en l’occurrence une carcasse de mâle lavé à l’hexane), ce qui induisait le comportement de cour des mâles situés à proximité. Malheureusement, nos tentatives pour répliquer ce résultat chez A. japonica n’ont pas été fructueuses pour le moment. La validation du rôle des esters nécessiterait également d’isoler et de purifier ces composés, afin de pouvoir les déposer sur les leurres dans différentes proportions.

Figure 4.11. Relation entre les quantités des deux esters chez les femelles A. japonica (lignées thélytoques : Kagoshima, Sendaï et Tokyo, lignée arrhénotoque : Iriomote).

4.4. Discussion 4 : Mécanismes proximaux et causes évolutives de

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