DISCU5SION

La présence de zinc in vitro modifie La synthèse d'ADN par Les Lympho­ cytes stimuLés en cuLture à La PHA. L'effet est faciLitant, de très

faibLe intensité et irréguLier en-dessous de 10 pM. Nous ignorons Les causes de cette variabiLité. Au-deLà de 25 pM, nous observons une réduction de La réponse qui s'accentue Jusqu'à 100 pM sans que ceci soit Lié à une toxicité ceLLuLaire du zinc. IL n'y a pas d'ana-

Logie entre L'effet direct du zinc et L'infLuence de La prise oraLe de zinc in vivo sur La réponse Lymphocytaire à La PHA.

134.

Les variations de réponse observées ici ne sont pas superposables à celles enregistrées après la prise orale de zinc, malgré que nous ayons testé un spectre de concentration qui dépasse celui des varia­ tions de la zincémie in vivo (70 à 280 yg/100 l, soit environ 10 à 40 yM de zinc lié à diverses protéines). Nous en concluons que

l'effet du traitement au zinc ne s'explique pas par un effet direct de celui-ci sur les lymphocytes, ce qui s'accorde avec l'absence de corrélation entre la réponse lymphocytaire in vitro et le niveau de zincémie.

Nous observons une inhibition de la réponse lymphocytaire à la PHA en présence de concentration de 100 yM de zinc chez la plupart des

individus testés quel que soit leur âge. Il est vrai que cette inhibition s'accroît de façon relative avec l'âge, ce qui s'accorde partiellement avec l'observation de Rao et al. (6). Toutefois, ces auteurs ne l'observaient que chez les sujets âqés et par stimulation à la Con A et non à la PHA. Ces divergences peuvent s'expliquer par des différences de méthodologie ainsi que par la taille des groupes testés :

a) nos conditions de cultures sont à la fois moins optimales que les leurs et surtout utilisent moins de sérum. Nous verrons que ceci est très important car nous montrerons au chapitre 3 que la pré­ sence d'apotransferrine peut réduire considérablement et même abolir l'inhibition de la stimulation lymphocytaire par le zinc. b) ces auteurs n'ont testé que 5 paires d'individus pour l'inhibition

Par La suite Rao et al. ont montré que L'effet inhibiteur du zinc est attribuabLe à une action sur des structures sensibLes à La cyto- choLasine B, vraisembLabLement des microfiLaménts, une reLation déjà rapportée par Maro sur des thymocytes de rats (cf. supra). IL serait très étonnant qu'un phénomène de portée aussi généraLe atteigne Les Lymphocytes stimuLés par La Con A et non par La PHA quand on sait que Les 2 mitogènes stimuLent en grande partie Les mêmes ceLLuLes (26). L'intensité de cette inhibition pharmacoLogique par Le zinc ne

concerne pas ici des individus qui se distingueraient par une réponse anormaLe, pLus faibLe, comme Le sont Les réponses des sujets pLus âgés comparativement aux pLus jeunes.

Nos données suggèrent une toute autre interprétation. Nous sommes frappés d'observer que La moyenne des réponses à La PHA dans chaque groupe d'âge est diminuée de La même quantité en vaLeur absoLue (exprimée en CPM) en présence de zinc et que La différence de réponse entre Les groupes d'âges se reporte entièrement sur La partie de La

réponse qui n'est pas inhibée par Le zinc. A mesure que L'âge croît. Les réponses diminuent de façon progressive et significativement (p < 0,01 et P < 0,01, successivement pour chaque moyenne par rapport à La précédente, test t).

Nous proposons L'hypothèse suivante : La présence de zinc in vitro affecte La synthèse d'ADN de certaines ceLLuLes dont Le nombre qui est stimuLé en cuLture ne change pas avec L'âge. Par contre. Les ceLLuLes qui ne sont pas inhibées par La présence de zinc deviennent de moins en moins stimuLabLes ou disparaissent avec L'âge.

136.

Nous suggérons qu'il s'agit de Lymphocytes T parce qu'ils sont stimulés au cours d'une activation par La PHA, et que ce sont ceux qui collabo­ rent avec les lymphocytes B.

Cette hypothèse tient compte des faits suivants :

a) Delespesse a montré qu'au cours du vieillissement, il apparait un défaut de collaboration des Lymphocytes B et T dans La prolifération de ceux-ci (27); en particulier, ce phénomène apparaît vis-à-vis d'une sous-population de lymphocytes T, dont Le nombre se réduit avec l'âge, et caractérisée par :

- Leur faible adhérence à La Laine de nylon

- Leur dépendance plus étroite à la présence de monocytes. Lympho­ cytes B ou polynucléaires pour synthétiser de l'ADN.

b) Le zinc stimule des Lymphocytes T helper qui induisent La diffé­ rentiation de Lymphocytes B en cellules productrices d'anticorps et formant des plages de lyse. Ceci a été bien démontré par

Cunningham-Rundles et al. (il). Cet effet d'activation polyclonale des Lymphocytes B requiert La présence de cellules T, s'apparente à celui du PWM, de l'anatoxine diphtérique et de la PPD qu'il potentialise d'ailleurs. Il est absent chez des malades atteints de déficits immunitaires communs et variables caractérisés par un défaut de production d'anticorps. Il est optimal à La concentration de 100 à 150 pM de zinc in vitro, qui est celle que nous utilisons ici. IL est peu vraisemblable que le zinc puisse stimuler ces Lymphocytes T dans leur rôle de collaboration avec Les B, à La manière d'autres activateurs, et qu'il ait un effet inhibiteur sur

Leur prolifération propre, d'autant que le zinc est mitogène pour une sous-population de Lymphocytes T (et non pour des cellules B pu ri fiées) (10).

Nous pensons donc que le zinc n'inhibe pas la réponse proliférative des lymphocytes T helper collaborant avec les cellules B.

Notre hypothèse n'est pas incompatible avec un effet du zinc sur­ venant précocement au cours d'une activation in vitro, et médié par une action sur les microfilaments. La restriction partielle de la mobilité de certains récepteurs pourrait faciliter des interactions cellulaires en prolongeant les contacts entre cellules, en per­ mettant une accumulation plus importante de facteurs facilitants à la surface des cellules stimulables et conduisant ainsi à une activation ultérieure plus importante pour certaines cellules. D'ailleurs, à faible concentration, la cytochalasine B (CB) augmente

légèrement la stimulation lymphocytaire par la Con A (7), effet potentialisé par le zinc à 100 pM pour une concentration plus faible de CB. Néanmoins, ce mécanisme n'est pas apparent dans nos cultures, ce qui suggère que d'autres mécanismes puissent entrer en jeu. En particulier, le transport intracellulaire du zinc. Nous verrons que dans des conditions de culture où celui-ci est modifié, l'effet pharmacologique du zinc peut être aboli ou étendu.

Il est possible que le mécanisme de transport du zinc soit moins efficient ou rapide avec l'âge. Ce point sera abordé au chapitre 8 et au chapitre 11.

VI. CONCLUSION

Nous avons étudié l'effet de concentrations de zinc comprises entre

-7 -5

10 et 10 M sur la synthèse d'ADN par des lymphocytes du sang périphérique stimulés par la PHA.

138.

Nos données montrent que nous n'obtenons pas d'effet stimulant qui soit comparable à celui qui est observé chez les sujets adultes et jeunes, après traitement in vivo.

Ceci nous indique :

a) que l'effet du traitement au zinc n'est pas un effet pharmacologique direct sur les cellules préexistantes.

b) que les modifications de réponses observées après traitement in vivo sont en rapport avec une composition cellulaire différente

induite par le traitement.

L'effet inhibiteur du zinc, à forte concentration (100 yM) sur la réponse lymphocytaire n'est pas caractéristique des sujets âgés contrairement à ce qui a été rapporté dans une étude analogue, mais ce qui distingue entre la réponse des sujets jeunes et âgés réside dans la partie de la réponse qui n'est pas inhibée par le zinc in vitro. Nous suggérons que ce dernier phénomène met en jeu des interactions de lymphocytes T-B dont la collaboration réciproque diminue avec l'âge à la fois sur le plan fonctionnel et par réduction d'une sous-population particulière de lymphocytes T helper. Cette interprétation a le mérite de réunir des données apparemment éloignées et contradictoires sur des effets inhibiteurs ou facilitant du zinc dans des processus de différenciation et de collaboration cellulaires in vitro et in vivo. Elle est compatible avec les données indiquant que le zinc agit surtout sur des phénomènes de la membrane plasmatique lymphocytaire et pourrait expliquer en partie l'effet facilitant du zinc sur la collaboration T-B dans des circonstances où celle-ci est réduite comme par exemple au cours de la production d'anticorps in vivo chez les sujets âgés.

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Chapitre 8

LE BESOIN DE TRANSFERRINE EN CULTURE LYMPHOCYTAIRE EST LIE A SON ROLE DE TRANSPORT INTRACELLULAIRE DU ZINC

PP.

I. Introduction 144,

1. Besoin de transferrine

2. Récepteurs de La transferrine et de La transferrine-zine 3. Incorporation de zinc intraLymphocytaire

4. Hétérogénéité des données

I I , But du travaiL 148.

II. MatérieL et méthode 150.

VI. Résu Ltats 150.

1. Effet faciLitant de La TF en L'absence de sérum 2. InfLuence de La TF sur La chéLation de zinc par EDTA 3. Effet de La TF sur un excès de zinc

V. Discussion 156.

VI. ConcLusion 160.

144.

Chapitre 8

LE BESOIN DE TRANSFERRINE EN CULTURE LYMPHOCYTAIRE EST LIE A SON ROLE DE TRANSPORT INTRACELLULAIRE DU ZINC

I. INTRODUCTION

'• §ËË2iQ_^®_^EËQ§^®LEiQ§

La nécessité de suppléments de sérum pour assurer Le développement optimal des cultures de lymphocytes humains est dû à la présence de transferrine (TF). Elle peut Le remplacer dans un milieu synthétique additionné d'albumine bovine (1, 2) quel que soit l'agent stimulant : mitogène, antigène, cellule allogénique. Sa présence est requise dans Les 5-6 heures qui précèdent La synthèse d'ADN et pas durant les premiers instants de L'activation, ce qui suggère l'existence de récepteurs spécifiques de la transferrine jouant un rôle homéostatique dans la phase et S de la réplication cellulaire.

Philippe et Azari ont montré que La présence de complexes de TF et de 2 atomes de zinc ou de 2 atomes de fer (tri va Lent) amélioraient la synthèse d'ADN et d'ARN Lymphocytaire, en L'absence de sérum, et permettaient L'accumulation intracellulaire de ces 2 ions dans Les premières 24 heures d'une culture stimulée par la PHA (3, 4). Ces effets n'étaient pas reproductibles par L'addition des ions Zn** et Fe isolément, avec de L'albumine ou de L'ovotransferrine.

2. Récegteu rs_de_]^a_t ransferrj_ne_et_de_]^a_t ransferr me-zj_nc

Philipps établit ensuite L'existence d'une liaison spécifique de L'apotransferrine et de la transferrine-zine sur des Lymphocytes humains fraîchement isolés à l'aide de TF marquée à L'iode 125 (5).

Cette Liaison est rapide (en 5 à 10 minutes), saturable, réversible et spécifique. L'affinité, maximale pour la TF humaine, se réduit pour les transferrines hétérologues (60 % pour La TF bovine présente dans Le sérum de veau). Elle n'est pas altérée par la PHA, même après 72 heures d'incubation à 37° C.

L'incorporation de zinc s'accroît sous L'effet de la stimulation Lymphocytaire par La PHA et non par la Con A ou le PWM (6). Elle culmine 1 heure après le début de La stimulation et décroît progres­ sivement de La 5e à La 25e heure. Elle est favorisée par des agents qui accroissent Le taux intracellulaire d'AMP cyclique (adrénaline, histamine, sérotonine, glucagon, prostaglandine E^, dibutyruL, AMP cyclique) et par la poly-L-ornithine, un agent facilitant La pino- tose.

t!ÉlÉE22ÉQ2li2_22Ë_'^°'^D22§

Ces observations, partiellement contradictoires, s'opposent à celles d'autres auteurs et aux nôtres telles qu'elles seront rapportées plus loin. Leur interprétation exige plusieurs remarques :

a) L'existence de récepteurs Lymphocytaires pour la TF et La TF-Zn est clairement établie. Mais la méthode utilisée ne permet pas d'affirmer que cette propriété soit partagée par tous Les Lympho­ cytes ou par une fraction seulement. C'est pourquoi, nous choi­ sirons une autre méthode de détection, à savoir : La formation de rosettes pour Les Lymphocytes incubés en présence d'hématies humaines recouvertes de TF et de TF-Zn.

146.

Nous verrons ainsi que ces récepteurs ne s'observent que sur 10 % environ des lymphocytes humains fraîchement isolés, mais que leur nombre est fonction de l'activation cellulaire en culture quel que soit le moyen utilisé (mitogène, antigène, etc.). Ceci s'oppose aux observations de Philipps pour qui la capacité de

liaison ne change pas au cours d'une culture à la PHA, et ne serait même pas accrue par la Con A ou le PWM.

b) Ces récepteurs permettent l'incorporation de zinc ou de fer transporté par de la TF, ions dont la présence facilite la syn­ thèse d'ADN et d'ARN par les lymphocytes stimulés. Ceci est en accord avec les observations précédemment mentionnées

indiquant la présence indispensable de TF et de zinc dans de telles cultures.

Cependant, selon Philipps, le rôle de la TF est limité surtout aux 5 à 10 premières heures de culture stimulée, alors que, selon Tormey et al., le besoin de TF n'est indispensable que vers la 26e heure de culture et est sans influence sur les événements précoces de l'activation lymphocytaire.

Ces divergences peuvent s'expliquer par des conditions de culture différentes ; l'absence de sérum ou d'albumine est très défavora­ ble à la survie (80-90 % de mortalité) et à la prolifération des

lymphocytes. L'incorporation de thymidine tritiée se limite à 5-15 % de celle obtenue en présence de sérum ou d'albumine. Il s'ensuit des perturbations de la cinétique de croissance et la prolifération n'est plus comparable à celle de conditions plus optimales.

c) Les mesures de liaison de La TF radiomarquée ne tiennent pas compte :

- de La présence préalable de TF : or, Tormey avait montré que Les Lymphocytes Libèrent de La TF dans Les 4 à 6 premières heures de culture à 37° C (7).

- de L'incorporation probable de TF par Les Lymphocytes au vu de L'effet facilitant de La poLy-L-ornithine sur La Liaison de TF et d'autre part sur La pinocytose (6).

- de La synthèse éventuelle de TF de novo en culture illustrée par SoLtys et aL. (8).

- de La présence de TF dans Les Lymphocytes T et Les polynucléaires Nishiya et al. (9). De plus, après 1 nuit d'incubation à 4° C, certains Lymphocytes T sont entourés d'un halo de TF, ce qui ajoute La possibilité d'une Libération ou d'une sécrétion de TF

intracellulaire dans Le milieu.

Il ressort que La cinétique de La Liaison de La TF doit être dissociée de L'incorporation du zinc ou du fer. C'est d'aiLLeurs ce qu'observe PhiLipps sans L'expliquer, à propos de L'effet du

125 Na F qui réduit la Liaison Lymphocytaire de complexes I TF-Zn (5) mais augmente L'incorporation de zinc par TF-Zn^^ (6).

CelLe-ci est sûrement influencée par compétition avec La TF pré­ existante et son degré de saturation pour L'un ou L'autre ion. Ces considérations indiquent également que les cultures sans sérum contiennent quand même de La TF, et vu La contamination ubiquitaire de zinc, des traces de zinc; ces deux éléments sont ensemble capa­ bles de permettre une certaine prolifération.

148.

II. BUT DU TRAVAIL

Nous avons voulu établir que le rôle de la transferrine dans les cultures lymphocytaires stimulées par la PHA était lié à sa fonction de protéine porteuse du zinc nécessaire à la synthèse d'ADN. Notre

investigation porte sur des réponses lymphocytaires dont le niveau est quasi optimal et montre que cette relation concerne tous les

lymphocytes activés. Nous avons contrôlé l'apport de zinc intracellu­ laire par l'usage de chélateurs et celui de la transferrine par l'usage d'un milieu sans sérum mais enrichi en protéines sous la forme d'albu­ mine bovine dialysée. Cette dernière, utilisée à la concentration

finale de 2 %, améliore considérablement la survie in vitro des lympho­ cytes même non activés. Nous avons comparé l'effet de petites quantités de transferrine, sous forme d'apotransferrine purifiée et faiblement contaminée (5 ^ de TF-fer) à celui du sérum.

Remargue : l'EDTA est utilisé comme chélateur parce que la forme majeure du complexe EDTA-zinc est ionisée (EDTA-Zn ), ce qui rend

impossible sa pénétration intracellulaire. Par contre, l'orthophénan- troline utilisée précédemment (chapitre 6) forme avec le zinc un com­ plexe non ionisé, ce qui lui permet de jouer un rôle d'ionophore (de même que la pénicillamine). On sait que l'utilisation in vivo de péni- cillamine (comme chélateur au début du traitement de l'intoxication au plomb par exemple) peut précipiter la toxicité du métal sur les organes cibles en facilitant sa diffusion intracellulaire depuis le plasma sous

forme complexée, alors que ce n'est pas le cas de l'EDTA (10). En confinant la chélation du zinc au compartiment extracellulaire, nous facilitions l'interprétation de nos résultats.

FIG. 1

CPM

TF (jug/ml )

F_i_gure_2

Effet facilitant de la transferrîne sur la synthèse d'ADN de lymphocytes stimulés

par la PHA, en l'absence de sérum (en présence d'albumine bovine 2 %).