III.2. Résultats et discussion
III.2.4. Détermination du taux de couverture total en enzymes par XPS
Nous avons également cherché à calculer le taux de recouvrement de la laccase à partir des résultats XPS. A l’inverse des deux méthodes précédentes, celle-ci présente l’avantage de prendre en compte toutes les enzymes immobilisées, qu’elles soient actives ou non. Le spectre
85 XPS (Figure III.9) obtenu après immobilisation de la laccase montre clairement la présence d’enzyme à la surface de l’électrode par l’augmentation des pics représentatifs des groupements présents sur la protéine. Par comparaison avec les spectres obtenus avant immobilisation de la laccase (Figure III.9A et B), on note également une augmentation significative de l’intensité du pic à 288 eV représentatif des groupements carboxyliques, ainsi que des groupements amides.
Figure III.9: Spectre XPS et décomposition du pic C1s d’une électrode A) graphite/a-CN0,17
en présence de laccase et B) en absence de laccase
Pour le calcul du taux de recouvrement de la laccase à partir des données XPS, on pourrait se baser sur les intensités de trois éléments : l’oxygène, le carbone ou le cuivre, tous trois présents dans l’enzyme. Cependant, le carbone et l’oxygène sont présents également dans le support ce qui complique les calculs. On a donc décidé de baser nos calculs sur l'analyse quantitative du cuivre, élément présent uniquement dans la laccase. L'analyse quantitative du taux de couverture de la laccase à partir des données XPS repose sur la comparaison du rapport d'intensité du signal ICu/IC1s expérimental avec celui calculé pour différents taux de recouvrement à l'aide de deux modèles de répartition de l’enzyme en surface (Schéma III.1).
Schéma III.1: Représentation schématique d’une surface de a-CNx recouverte par une couche discontinue de laccase en supposant que l’enzyme a une forme hémisphérique (modèle A, chaque hémisphère représente une enzyme) ou rectangulaire (modèle B, couche
discontinue d’épaisseur d, un rectangle peut représenter plusieurs enzymes regroupées)
300 295 290 285 280 275
86 Le premier modèle A suppose que la géométrie de l'enzyme déposée est une demi-sphère et conduit à l'expression suivante pour le rapport ICu/IC1s (Equation III.6) [92]:
ICu
IC1s= γ.nCuenzyme.σCu.T(ECu).λCuenzyme.[1-Λ]
γ.nC1sCNx.σC1s.T(EC1s).λC1sCNx.Λ+(1-γ).nC1sCNx.σC1s.T(EC1s).λC1sCNx+γ.nC1senzyme.σC1s.T(EC1s).λC1senzyme.[1-Λ] (Eq. III.6) Avec Λ facteur d’atténuation du signal dû à la présence d’une couche déposée
Λ=( 8λ2
denzyme2) [1-(denzyme
2λ +1)exp(-denzyme
2λ )] (Eq III.7)
Le deuxième modèle B repose sur l'hypothèse que l’enzyme recouvre la surface sous la forme d’une couche discontinue d’épaisseur « d » uniforme (Equation III.8).
ICu concentrations de cuivre et de carbone dans l’enzyme et nC1sCNx la concentration de carbone dans la couche mince d’a-CNx. Pour celle-ci, la concentration a été calculée à partir du ratio des densités ρa-CNx=ρgraphite=2,1. Pour l’enzyme, la concentration d’un élément a été calculée à partir de l’équation suivante : C2399H3600N638O729S9. La laccase renferme aussi dans sa structure quatre chaines glycosydiques [4] formées chacune de 11 mannoses et de 2 N-acetyl glucosamines. On doit donc rajouter 328 atomes de carbone. Au total, on a donc NCenzyme = 2727. Par ailleurs NCuenzyme= 4
σCu et σC1s représentent les sections efficaces de l’azote et du carbone respectivement.
T(ECu) et T(EC1s) représentent les facteurs de sensibilité de l’instrument pour le cuivre (63,5) et le carbone (1,0) respectivement.
λCuenzyme (1,5 nm), λC1sCNx (3,3 nm) et λC1senzyme (3,3 nm) représentent les libres parcours moyens des électrons du cuivre à travers la couche d’enzyme, et des électrons du carbone dans la couche d’a-CNx et de l’enzyme, respectivement.
La laccase a pour dimensions 5×5×7 nm. Pour la suite des calculs, on a supposé que la couche discontinue d’enzymes recouvrant la surface de l’électrode pouvait avoir une épaisseur
87 de 5 nm ou de 7 nm. L’intensité du signal du carbone est décrite comme étant la somme de la contribution de trois termes : le signal de la couche d’a-CNx recouverte par la laccase, le signal de la partie d’a-CNx non recouvert par la couche d’enzyme et le signal du carbone présent dans la structure de la laccase. Deux modèles ont été utilisés pour le calcul des taux de recouvrement.
On observe d’une manière générale pour les deux modèles considérés que les taux de recouvrement les plus bas ont été obtenus lorsque la laccase est simplement adsorbée. On observe aussi que les valeurs des taux de recouvrement calculées à partir du modèle A sont environ 50-60 % supérieures à celles du modèle B. Par exemple, dans le cas d’une électrode graphite/a-CN0,17 sur laquelle de la laccase oxydée a été immobilisée en présence d’un agent de couplage, le taux de couverture est de 45 % pour le modèle B et de 76 % pour le modèle A. On constate aussi que pour un modèle donné, la taille de l’enzyme (5 ou 7 nm) n’a pas une grande influence sur les résultats de taux de recouvrement. En comparant les modes d’immobilisation de la laccase, on constate que les taux de recouvrement sont plus élevés dans le cas d’un greffage covalent et lorsque la laccase est immobilisée par la formation d’une liaison amide et imine que lorsqu’elle est simplement greffée via la formation d’une liaison imine uniquement.
Ce résultat est en accord avec les résultats de courants obtenus. Par ailleurs, le taux de couverture déterminé à partir des données XPS est toujours plus faible que celui calculé à partir de l’activité mais permet une estimation plus précise de la quantité d’enzyme présente à la surface de l’électrode. Ce dernier ne prend pas en compte l’orientation que peut avoir la laccase à la surface de l’électrode et donc ne permet pas d’avoir une sur/sous-évaluation de la quantité d’enzyme immobilisée. Il permet d’avoir une analyse quantitative et non qualitative.
En comparant les valeurs de taux de couverture soit de l’activité enzymatique soit des données XPS, on remarque que dans le cas d’une électrode graphite/a-CN0,17 AT, les résultats sont assez semblables lorsqu’on suppose que la laccase a une forme hémisphérique et une taille de 7 nm. Le taux de couverture calculé à partir de l’activité est de 24 % (liaison imine) et de 69
% (liaison imine et amide). Les valeurs prédites à partir des données XPS sont de 28 % (liaison imine) et 61 % (liaisons imine et amide). Cependant, dans le cas d’une électrode graphite/a-CN0,17, on observe un écart entre les deux méthodes de calcul. Le taux de couverture calculé à partir de l’activité enzymatique est environ de 100 % quelle que soit la méthode de greffage alors que pour les mesures XPS les valeurs dépendent du type d’immobilisation et du modèle.
On a calculé par exemple pour une taille de 7 nm un taux de couverture de 17 % (modèle A) et
88 13 % (modèle B) lorsqu’on a une liaison imine uniquement et 64 % (modèle A) et 44 % (modèle B) lorsqu’on a deux types de liaisons à la surface (imine et amide). On peut dire à ce stade que le modèle hémisphérique est le plus représentatif sur la base de la comparaison de l’activité et des données XPS.
III.2.5.Détermination du taux de couverture total en enzymes et de leur orientation