Détermination du taux de couverture total en enzymes et de leur orientation sur le substrat par AM-AFM et PI-AFM

Afin d’avoir de plus amples informations sur l’orientation de l’enzyme à la surface du support, des études par microscopie à force atomique (AFM) en modulation d’amplitude (AM-AFM) et en imagerie de phase (PI-(AM-AFM) ont été réalisées (Figure III.10, Figure III.11).

Figure III.10: Images obtenues par AFM (20×20 µm²), (gauche: topographie (AM-AFM), droite: phase (PI-AFM)) d’une électrode Si/a-CN0,17 avec la laccase naturelle immobilisée en

présence d’EDC-NHS. Sur les profils 1), 2), et 3) : ___ pour la topographie, et …. pour la phase.

89 Figure III.11: Image de topographie obtenue par AM-AFM (20×20 µm²) d’une électrode Si/a-CN0,17 sur laquelle de la laccase oxydée a été immobilisée, après un test de nano-grattage

effectué en mode contact, b) profil de topographie tracé selon la ligne noire apparaissant sur l’image.

On a déposé une couche mince de nitrure de carbone amorphe sur une plaque de silicium sélectionnée pour son caractère extrêmement lisse. Ensuite, la laccase a été immobilisée de manière covalente par la formation soit d’une liaison amide dans le cas de la laccase naturelle (Figure III.10), soit par la formation d’une liaison imine dans le cas de la laccase oxydée (Figure III.11). L’observation des images AFM obtenues en mode tapping (AFM en modulation d’amplitude, ou AM-AFM) montre que la laccase naturelle immobilisée en présence d’un agent de couplage sur une électrode Si/a-CNx ne forme pas une couche continue (Figure III.10 à gauche). On remarque également que cette dernière semble présenter différentes conformations à la surface du support. En effet, d’après l’image de phase (Figure III.10 à droite), on observe une différence de contraste au niveau de la surface (variation de couleur) qui est confirmée par les profils de topographie obtenus. Sur l’image de phase, on observe trois types de zones. Celles qui sont noires (11 %) correspondent à des zones dures attribuées à la couche d’a-CNx nu.

Celles qui sont blanches (33 %) ou marron-beige (56 %), et donc plus molles, peuvent quant à elles être attribuées à la couche d’enzyme. La recherche de corrélation entre les profils de topographie et de phase (voir les superpositions des profils 1, 2 et surtout 3 dans la Figure III.10), permet de constater que les zones blanches sur l’image de phase correspondent toujours à des zones plus creuses sur l’image de topographie. Par ailleurs, l’examen notamment du profil 1 permet d’estimer l’épaisseur de la couche d’enzyme apparaissant en marron clair sur l’image de topographie et en marron sur l’image de phase à 5 nm environ. En conséquence, les zones

5 nm

90 blanches apparaissant sur l’image de phase pourraient correspondre à de l’enzyme dénaturée et donc plus molle que l’enzyme non-dénaturée qui elle serait donc orientée à plat sur la couche d’a-CNx, compte-tenu de son épaisseur. D’après les données AFM pour une électrode Si/a-CN0,17 sur laquelle de la laccase a été immobilisée, on peut dire que la surface du silicium est recouverte à 89 % de laccase. En comparant ce résultat au taux de recouvrement obtenu par XPS (70 %) dans le cas du modèle hémisphérique on peut dire que les résultats se rejoignent.

La différence peut être expliquée par la nature du support utilisé (silicium pour l’AFM et graphite pour l’XPS)

Dans le cas du greffage de la forme oxydée de la laccase, on a observé toujours à l’aide du mode tapping de l’AFM la formation d’une couche d’enzyme couvrant complètement la surface du graphite. On a ensuite procédé à un test de nanograttage afin de déterminer l’épaisseur de la couche d’enzyme. Pour cela, on a balayé en mode contact une zone de 500x500 nm² à une vitesse de 1991 nm/s et en appliquant une force normale d’appui de 0,5 µN. Ces conditions de nanograttage sont sélectives vis-à-vis de la couche d’enzymes car il a été vérifié dans une expérience préliminaire qu’elles ne permettent pas d’endommager la couche d’a-CNx nu. Sur l’image AFM de lecture obtenue en mode tapping du test de nanograttage de la surface qui est représentée sur la Figure III.11, on constate que cette couche possède une épaisseur de 50 Å, ce qui, connaissant la géométrie de la laccase, confirme la présence d’une monocouche d’enzyme complète.

Plusieurs études par AFM de la laccase immobilisée sur la surface d’une électrode ont été précédemment décrites dans la littérature. Ainsi, Pankratov et al. [93] ont immobilisé par adsorption deux oxydases multi-cuivres (la laccase Trametes hirsuta (dimension 45×55×65 Ȧ) et la bilirubine oxydase de Myrothecium verrucaria (dimension 40×50×60 Ȧ) sur une surface d’or polycristallin. Ils observent par imagerie par AFM en mode tapping après adsorption de l’enzyme à partir d’une solution concentrée ou diluée, une structure granuleuse similaire à celle caractéristique de l’or nu dont les grains ne sont cependant plus aussi lisses. D’après les auteurs, la surface d’or semble être recouverte par une sorte de structure globuleuse ayant pour largeur moyenne 20 nm, ce qui est nettement supérieur à la dimension d’une laccase ou d’une bilirubine. Ils ont par ailleurs mesuré d’après les images AFM pour les deux enzymes une épaisseur entre 4-6 nm et une hauteur de 2,9 ± 0,6 nm et de 3,0 ± 0,8 nm pour la laccase et la bilirubine respectivement. Ils estiment que pour les deux types d’enzymes, un recouvrement

91 total est observé. Selon eux, il est normal d’observer des hauteurs d’enzyme inférieures à leurs dimensions car la valeur de la hauteur d’un matériau mou tel qu’une couche d’enzyme mesurée par AFM est toujours inférieure à celle attendue, à cause de la compression de la matière par la pointe AFM. Arzola et al. [94] ont aussi essayé de caractériser un film de laccase par AFM en mode tapping sur une surface d’or ainsi que sur du graphite HOPG. Les films de laccase ont été obtenus par immersion des électrodes dans une solution d’enzymes à différents temps d’incubation. Les résultats AFM montrent que dans le cas d’une électrode d’or, la surface est totalement recouverte par un film uniforme, compact ayant une structure globuleuse. Dans le cas d’une surface de graphite HOPG, l’adsorption de la laccase à la surface de l’électrode s’effectue de manière plus lente que sur une surface d’or avec aussi une forte tendance des molécules de laccase à former des agglomérats. La surface du graphite n’est pas totalement recouverte par de l’enzyme. La laccase forme des agglomérats d’une largeur variant entre 50 et 70 nm et d’une hauteur de 3-5 nm. Pita et al. [41] ont quant à eux fonctionnalisé une surface d’or par des sels de diazonium puis immobilisé la laccase de Trametes Hirsuta. Après immobilisation de la laccase, ils observent l’apparition de structures globuleuses réparties de manière aléatoire à la surface qui peuvent être attribuées à de la laccase. Traunsteiner et al. [95]

ont immobilisé de la laccase de Trametes versicolor sur une surface d’or fonctionnalisée par des SAMs (« Self Assembled Monolayer »). Ils observent que la laccase couvre l’ensemble de la surface. L’épaisseur de la couche est d’environ 9 nm, ce qui est supérieur au plus grand diamètre de la laccase de Trametes versicolor.

III.2.6.Evaluation de la stabilité de l’activité bioélectrocatalytique de la laccase