Cf. chapitre 10.
Le nœud d’émail est le centre de signalisation qui permet la mise en place des cuspides. Un certains nombre de gènes sont connus pour être exprimer dans les nœud d’émail au cours du développement, tel que Bmp4, Fgf4, p21 (Cdkn1a), ... [Jernvall et al. , 1994, 1998]. Nous avons voulu tirer parti de notre jeu de données bucco-lingual afin d’identifier de nouveaux marqueurs potentiel du nœud d’émail (EK). En effet, au stade auquel nous avons échantillonné le jeu de données BL, le stade ED15, il y a la présence d’un nœud d’émail uniquement du côté buccal. Ainsi, au milieu des gènes exprimés avec un fort biais buccal (car pas de présence de EK côté lingual), il doit y avoir des marqueurs de nœud d’émail. Afin de faire le tri au milieu des ces gènes fortement biaisé buccalement, j’ai utilise des données d’expression de tissus pures : EK au stade
Chapitre 4. Analyse des données RNA-seq
ED14.5 et épithélium aux stade ED13/ED13.5 [O’Connell et al. , 2012]. J’ai utilisé le r at i oE K défini plus haut (p. 78). Pour chaque valeur de r at i oE K j’ai compté, soit de manière cumulative soit de façon ponctuel pour chaque valeur du r at i oE K , le nombre de gènes qui sont biaisés du côté buccal ou du côté lingual avec un enrichissement d’au moins deux fois ainsi que les gènes non différentiellement exprimés. J’ai ensuite pu représenter graphiquement ces données (voir figure supplémentaire B du chapitre 10). Ceci nous a permis de définir des seuils “d’émaillitude” pour lesquels nous avions un bon compromis entre la spécificité d’un gènes et la sensibilité avec laquelle nous avons pu identifier ce gènes.
FIGURE4.5 – Estimer des proportions tissulaires. A. Représentation théorique du principe des déconvolutions visant à estimer des proportions tissulaires. La matrice des niveaux d’expres-sion (X ) est la combinaison linéaire de la matrice de signature (S) et de la matrice de concen-tration (C ). B. Représentation schématique d’un jeu de données de bourgeon de molaire à trois stades de développement différents. Connaissant le niveau d’expression global dans la molaire (matrice X ) ainsi que les gènes marqueurs des différents tissus qui composent la molaire (matrice S), les proportions (matrice C ) de chaque tissu dans l’échantillon de départ peuvent
Cette méthodologie se rapport au chapitre 10
J’ai réalisé la mise au point du protocole permettant de réaliser les reconstructions 3D des germes de molaires, dont le principe général est représenté figure 5.1. D’abord j’ai réalisé l’im-munolocalisation in toto des bourgeons de molaires avec l’anticorps anti-lamininα5 afin de marquer la lame basale qui est à l’interface entre l’épithélium et le mésenchyme. Ensuite, j’ai inclus ces bourgeons dans l’agarose low-melting afin d’orienter le germe correctement. Puis j’ai réalisé une étape de clarification au BA/BB (benzyl alcool / benzyl benzoate) afin de rendre transparent les échantillons pour permettre leur acquisition par un microscope à fluorescence. Enfin j’ai utilisé un microscope biphoton (qui reduit le photo-blanchiment) pour réaliser l’acqui-sition des images en sections transversales. Ensuite j’ai testé deux logiciels d’imagerie pour la reconstruction 3D des bourgeons imagés : le logiciel Imaris (http://www.bitplane.com/) et le logiciel Amira (https://www.fei.com/software/amira-3d-for-life-sciences/). Nous avons retenu le logiciel Amira qui était plus approprié à nos besoins.
Bien que ce protocole permettait de reconstituer correctement la forme de l’épithélium aux stades ED15 et ED15.5, nos données RNA-seq large échelle de souris ont montré que la la-mininα5 est différentiellement exprimée au cours de la cuspidogenèse, ce qui signifie des fluctuations de l’intensité du marquage en fonction du stade de développement. Ceci n’était pas compatible avec notre but de réaliser ces reconstructions 3D pour la totalité de la cuspidogenèse. De plus, le marquage de la lame basale est assez irrégulier ce qui empêchait une reconstruc-tion quasi automatisée, demandant une intervenreconstruc-tion manuelle de l’opérateur sur la totalité des coupes utilisées pour la reconstruction 3D. Par la suite, c’est l’ingénieur de l’équipe qui a pris le relai sur ces expériences, il a résolu ce problème de reconstruction par l’utilisation d’un mélange d’anticorps anti-cytokératines pour marquer l’épithélium (et non plus la lame basale par anticorps anti-lamininα). Les résultats relatifs à ces reconstructions 3D se retrouvent dans le chapitre 10 ainsi que l’annexe A (figure supplémentaire 4).
Chapitre 5. Microscopie 3D
FIGURE5.1 – Principe de la reconstruction 3D de la forme de la molaire.
A. La forme à l’interface entre l’épithélium et le mésenchyme va donner la forme de la molaire au stade adulte (représenté en jaune). B. Le marquage de la lame basale par la lamininα5 permet de délimiter l’interface entre épithélium et le mésenchyme. Ce marquage nous a permis de reconstruire la forme 3D de la partie épithéliale du bourgeon de molaire à l’aide du logiciel Amira.
bucco-linguale
Matériels et méthodes du chapitre 11.
6.1 Hybridation in situ : caractérisation du patron d’expression de
Bmper
J’ai commencé à caractériser l’expression de bmper chez la souris pas in situ in toto. Pour cela, j’ai cloné une sous-partie du transcrit Bmper chez la souris afin de réaliser un sonde pour les hybridations in situ. En parallèle, j’ai disséqué des germes de molaire à différents stades (ED15,ED15.5 et ED16) puis j’ai réalisé des hybridation in situ pour Bmper ainsi que pour Fgf4 afin d’avoir un contrôle positif de la manipulation et aussi pour pouvoir marquer la position des noeuds d’émail. J’ai observé le patron d’expression de bmper au stade ED15.5 sur germe entier. J’ai ensuite inclus ces germes de molaires ayant subi l’hybridation in situ en paraffine afin de réaliser des coupes pour effectuer une une meilleure caractérisation du patron spatial d’expression. Pour contrôler l’orientation des germes, j’ai pré-inclus en agarose, puis j’ai déshydraté le tout avant de l’inclure en paraffine et d’effectuer les coupes au microtome. Cependant, le processus de déshydratation (en vu de l’inclusion en paraffine) lavait trop le signal de l’hybridation in situ in toto. Pour pallier à ce problème il faudrait mettre au point une in situ sur coupe cryostat.