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L E   DÉCLIN   DU   SYSTÈME   TA   CHROMOSOMIQUE   CCD O157   CHEZ   L ’ ESPÈCE   E SCHERICHIA   COLI

II. INTRODUCTION   :   LES   SYSTÈMES   TOXINE ‐ ANTITOXINE

IV.3   L E   DÉCLIN   DU   SYSTÈME   TA   CHROMOSOMIQUE   CCD O157   CHEZ   L ’ ESPÈCE   E SCHERICHIA   COLI

E

SCHERICHIA COLI

Si les systèmes TA ne constituent apparemment pas des modules de réponse au stress, comme expliqué en introduction, il semble néanmoins acquis que certains aient une fonction bien particulière (dans le développement, la persistance, la stabilisation de fragments génomiques ou l’anti-addiction).

Les systèmes TA ont de plus toutes les qualités requises pour être des gènes égoïstes, à savoir des gènes qui se maintiennent dans les génomes sans conférer d’avantage sélectif à leur hôte. En effet, une fois présents sur un plasmide ou même dans le chromosome, ils ne peuvent en être « délogés » (par perte du plasmide ou excision de l’opéron chromosomique) sans causer la mort de la cellule par PSK. Cette simple propriété suffirait à expliquer leur ubiquité. Il est d’ailleurs possible que certains soient recrutés par la suite pour une fonction particulière, comme décrit plus haut.

Néanmoins, des gènes dépourvus de fonction ne sont pas soumis aux mêmes pressions de sélection que des gènes essentiels. Ainsi, il est probable d’observer une évolution de type « neutre » à savoir une accumulation de mutations aléatoires, à distinguer de la sélection positive (certaines mutations précises favorisées à des endroits donnés de la séquence) et négative (aucune mutation possible).

Dans le cadre de l’étude de l’évolution des systèmes TA chromosomiques, nous avons

analysé la distribution du système ccdO157, un système homologue au système ccdF du

plasmide F, présent dans le chromosome de la souche E. coli O157:H7. La question

sous-jacente pourrait être formulée de cette manière : quelles sont les forces qui dirigent l’évolution de ccdO157 ? Cette étude a fait l’objet d’une publication [138] que je vais maintenant présenter.

ccdO157 est localisé entre deux gènes de ménage, folA et apaH. Afin d’étudier la

prévalence de ce système au sein de l’espèce E. coli, cette région intergénique a été examinée

chez 395 isolats d’E. coli représentant en tout 174 sérogroupes différents. Nous avons dans un

premier temps observé que le système ccdO157 n’est présent qu’au sein de 137 isolats,

représentant 47 sérogroupes. De plus, la grande diversité de cette région, même au sein d’isolats différents de la même souche, nous porte à croire que cette région est un site privilégié d’intégration de matériel génétique étranger.

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Parmi ces 137 isolats présentant un système ccd, un exemplaire de chaque sérogroupe représenté a été séquencé, conduisant donc à 47 séquences. Si nous avons constaté que les

gènes de l’antitoxine CcdAO157 sont extrêmement bien conservés (7 allèles), ce n’est pas le

cas des toxines (14 allèles). En effet, on observe au sein des séquences des gènes de toxines un grand nombre de mutations, qui vont de la simple substitution à la délétion pure et simple d’un fragment à l’extrémité 3’ de la séquence. Par ailleurs, ces toxines tronquées présentent encore des mutations retrouvées au sein d’autres souches. De ce fait, nous nous sommes

demandé si toutes ces toxines sont encore fonctionnelles. Des tests in vivo on révélé que

parmi les 12 testées, 7 de ces toxines ont encore une activité toxique, tandis que toutes les

antitoxines sont capables de contrecarrer l’effet de la toxine canonique CcdBO157 - sauf une

qui présente un décalage du cadre de lecture. Celle-ci est associée à une toxine non fonctionnelle.

Nous avons alors voulu estimer les forces de sélection à l’œuvre sur ces séquences. Pour cela, nous avons décidé de considérer plusieurs groupes de séquences : les toxines

CcdBO157, les antitoxines CcdAO157, les séquences correspondantes des gènes folA et apaH, et

un groupe de toxines CcdBF (homologues plasmidiques de CcdBO157). J’ai reconstruit

chacune des phylogénies correspondantes, et grâce à elle, j’ai estimé le ratio ω (voir

Introduction). Il s’avère que les antitoxines, ainsi que les toxines plasmidiques et les gènes

folA et apaH, sont soumises à une forte sélection négative, empêchant donc toute mutation.

Les toxines chromosomiques sont soumises à une sélection neutre, et donc n’importe quelle mutation peut s’y fixer. Cette pression de sélection au niveau de l’antitoxine peut s’expliquer soit par le fait qu’elle soit nécessaire à la survie tant que la toxine est fonctionnelle, et/ou par le fait qu’elle ait une autre fonction au sein de l’organisme (comme la capacité d’antagoniser une toxine d’un système plasmidique, agissant ainsi comme un module d’anti-addiction).

Ceci nous a permis de conclure au déclin du gène ccdBO157. En effet, la seule manière

par laquelle un système TA peut naturellement disparaître commence par une inactivation de la toxine, l’antitoxine étant nécessaire à la survie. Une fois que la toxine a perdu sa toxicité, l’antitoxine peut se retrouver dépourvue de rôle cellulaire et les contraintes de sélection peuvent être relâchées. Dans un premier temps, des mutations non incapacitantes apparaissent, telles que celles retrouvées au sein des toxines fonctionnelles. Puis des mutations, telles que la délétion d’un fragment 3’, ôtent à la toxine sa toxicité. Et alors seulement l’antitoxine peut elle aussi être mutée jusqu’à ne plus pouvoir contrecarrer une

toxine canonique, comme c’est le cas de la seule antitoxine non fonctionnelle que nous avons, associée à une toxine inactive.

Ces résultats nous ont permis d’établir un scénario d’évolution de ce système TA. Dans un premier temps, il a été intégré au chromosome à partir de matériel génétique étranger, acquis par l’intermédiaire d’un plasmide conjugatif. Dépourvu de rôle physiologique, et n’étant pas parvenu à être recruté par la bactérie pour remplir un tel rôle, la toxine est en train de disparaître. L’antitoxine peut être maintenue si elle a une autre fonction. Ce scénario est probablement applicable à d’autres systèmes TA chromosomiques. Ces

résultats nous permettent également de proposer l’hypothèse que le système ccd est un

élément génétique égoïste, dépourvu donc de fonction au sein de l’organisme. Il se trouve sur des éléments génétiques mobiles et peut être intégré au chromosome. De là, il peut soit être muté et/ou acquérir un rôle physiologique (tel que l’anti-addiction) ou disparaître progressivement.

Conclusion

La théorie du gène égoïste, décrite par Richard Dawkins dans son livre The selfish

gene publié en 1976, prédit notamment qu’un gène peut être ubiquiste, ou juste extrêmement

répandu, sans pour autant apporter d’avantage sélectif à l’organisme qui le porte. En effet, si la sélection naturelle de gènes nécessaires stabilise ceux-ci au sein des génomes, ce n’est pas le seul mécanisme possible de maintien. Si on considère un gène, ou un système de gènes, ayant la faculté naturelle de se rendre indispensable et/ou un bon mécanisme de transmission, celui-ci peut assez facilement envahir une population de génomes.

Les systèmes TA sont donc des candidats idéaux. L’instabilité de l’antitoxine, par rapport à celle de la toxine, fait qu’une fois présent au sein d’un organisme, celui-ci doit le transmettre à sa descendance afin qu’elle survive. De plus, les mécanismes de transfert horizontal de gènes, notamment via les plasmides, assurent aux systèmes TA plasmidiques une transmission parfois inter-spécifique. Si on associe cela à la possibilité que des gènes plasmidiques soient intégrés au chromosome, cela suffit à expliquer la présence quasi-systématique des systèmes TA chez les procaryotes.

Malgré sa simplicité, cette explication est assez mal perçue, la vision traditionnelle étant que lorsque l’on retrouve un gène au sein de nombreux génomes, c’est que celui-ci a une fonction bien précise. Néanmoins, les travaux effectués au laboratoire (délétion des systèmes 52   

canoniques chez E. coli, et l’étude précédemment décrite) prouvent qu’au moins certains d’entre eux sont dépourvus de fonction biologique. Ceci n’est pas incompatible avec les autres travaux mentionnés en introduction et décrivant des systèmes impliqués dans différents

processus cellulaires ; par ailleurs, le système ccd constitue peut être juste un cas particulier.

D’un point de vue évolutif, il est tout à fait logique qu’en tant que gènes égoïstes, les systèmes TA finissent par disparaître, une fois la toxine rendue inactive par mutation. De ce fait, le seul moyen pour un système TA, une fois intégré dans un génome, de survivre serait d’être recruté à une tâche particulière. Ce sont de tels systèmes dont les fonctions ont été décrites en introduction.

Pour le moment, la question de l’origine des systèmes TA a été abordée d’un point de vue fonctionnel. En effet, nous nous sommes demandé quel(s) type(s) de gène a(ont) pu

évoluer pour donner la diversité actuelle. Néanmoins, le fait que la région folA-apaH ne

présente pas toujours de système TA, même au sein de souches de la même espèce, amène à se demander si l’insertion à cet endroit d’un système s’est faite une fois, au sein d’un ancêtre commun, ou plusieurs fois au cours de l’évolution. La deuxième hypothèse suggère donc que l’origine « physique » des systèmes TA chromosomiques pourrait être les éléments génétiques mobiles (EGM), et que des sites d’insertion spécifiques pourraient exister. Les travaux, décrits ci-après, que nous avons démarré ont pour vocation de répondre notamment à cette question.  

CopyrightÓ2009 by the Genetics Society of America DOI: 10.1534/genetics.108.095190

The Decay of the Chromosomally Encoded ccd

O157

Toxin–Antitoxin System

in the Escherichia coli Species

Natacha Mine, Julien Guglielmini, Myriam Wilbaux and Laurence Van Melderen1

Laboratoire de Ge´ne´tique et Physiologie Bacte´rienne, Institut de Biologie et Me´decine Mole´culaires, Faculte´ des Sciences, Universite´ Libre de Bruxelles, 6041 Gosselies, Belgium

Manuscript received August 18, 2008 Accepted for publication January 27, 2009

ABSTRACT

The origin and the evolution of toxin–antitoxin (TA) systems remain to be uncovered. TA systems are abundant in bacterial chromosomes and are thought to be part of the flexible genome that originates from horizontal gene transfer. To gain insight into TA system evolution, we analyzed the distribution of the chromosomally encodedccdO157system in 395 natural isolates ofEscherichia coli. It was discovered in theE. coli

O157:H7 strain in which it constitutes a genomic islet between two core genes (folAandapaH). Our study revealed that thefolA–apaHintergenic region is plastic and subject to insertion of foreign DNA. It could be composed (i) of arepetitiveextragenicpalindromic (REP) sequence, (ii) of theccdO157system or subtle variants of it, (iii) of a large DNA piece that contained accdAO157antitoxin remnant in association with ORFs of unknown function, or (iv) of a variant of it containing an insertion sequence in theccdAO157remnant. Sequence analysis and functional tests of the ccdO157 variants revealed that 69% of the variants were composed of an active toxin and antitoxin, 29% were composed of an active antitoxin and an inactive toxin, and in 2% of the cases both ORFs were inactive. Molecular evolution analysis showed thatccdBO157is under neutral evolution, suggesting that this system is devoid of any biological role in theE. colispecies.

B

ACTERIAL chromosomes and plasmids harbor, often in multiple copies, addiction modules also known as toxin–antitoxin (TA) systems (for a review, see Gerdeset al.2005). They generally consist of two genes: a toxin-encoding gene whose product affects the bacterial metabolism (replication or translation) and an anti-toxin-encoding gene whose product binds to the toxin and counteracts its activity. The antitoxin is constantly degraded by an ATP-dependent protease while the toxin is a stable protein. This property renders the cell addicted to antitoxin production and therefore to the TA genes. This has been well documented for plasmid-encoded TA systems. Their biological role is to help maintain plasmids in growing bacterial populations by killing plasmid-free daughter bacteria (addiction phenomenon or postsegre-gational killing, PSK) (Gerdeset al.1986; Yarmolinsky

1995). The function(s) of chromosomally encoded TA systems, however, still remains unclear. While it was proposed that chromosomally encodedmazEFandrelBE

systems of Escherichia coli K-12 are stress response modules, it was recently shown that the five canonical TA systems ofE. coliK-12 (includingrelBEandmazEF) do not confer any selective advantage under a variety of stress conditions (Christensenet al.2003; Kolodkin -Galand Engelberg-Kulka2006; Tsilibariset al.2007).

This raises the distinct possibility that chromosomally encoded TA systems might be devoid of function, at least in the global stress response. Nevertheless, recent studies have highlighted a variety of physiological processes in-volving chromosomally encoded TA systems such as developmental programming (Nariyaand Inouye2008), persistence (Keren et al. 2004), stabilization of large genomic fragments (Szekeres et al. 2007), and anti-addiction (Saavedra De Bast et al. 2008). Thus, the functions of chromosomally encoded TA systems are likely to be quite diverse, depending on the type of TA systems, their genomic location (plasmid, genomic island, chromosomal core), and their host species.

Seven families of TA systems have been defined on the basis of the homology of the toxin proteins (Pandey

and Gerdes2005). One of the striking features of these systems is their wide distribution in bacterial and archeal genomes. Most of the genomes that have been sequen-ced do contain TA systems (Pandeyand Gerdes2005; Sevinand Barloy-Hubler2007) although to various extents. Some of the TA families are highly prevalent (such asrelBEandvapBC) while others appear to be less represented (phd-docandccd) (Pandeyand Gerdes2005). The ccd family is mostly confined to g-proteobacteria and only a small number of chromosomally encoded homologs have been identified and studied so far (Wilbauxet al.2007; SaavedraDeBastet al.2008).

A chromosomally encoded homolog of the ccdF

system of theE. coliF plasmid was previously

character-1Corresponding author:Laboratoire de Ge´ne´tique et Physiologie Bacte´ri-enne, Institut de Biologie et Me´decine Mole´culaires, Faculte´ des Sciences, Universite´ Libre de Bruxelles, 12 rue des Professeurs Jeener et Brachet,

B:6041 Gosselies, Belgium. E-mail: lvmelder@ulb.ac.be

ized in E. coli O157:H7 EDL933 and found to be expressed and still functional (Wilbaux et al. 2007). Indeed, the ectopic expression of this CcdBO157toxin is lethal through gyrase poisoning, while the coexpression of the CcdAO157 antitoxin relieves its toxicity. The

ccdO157 system is located between the folA and apaH

metabolic genes, coding, respectively, for a dihydrofo-late reductase and a diadenosine tetraphosphatase. Bio-informatics analysis on E. coli genomic sequences available at the time (17 partial or complete sequences) indicated a certain degree of plasticity in this region (Wilbaux et al. 2007). In the present work, we have analyzed thefolA–apaHintergenic region of a collection of 395E. coliisolates representing the 174 known sero-groups. The aim of this study is to evaluate the pre-valence of the chromosomally encodedccdO157system withinE. colispecies and to gain insight into the evolution of TA systems.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains:E. colistrains used in this work, their origin, and their pathogenic or commensal nature are listed in supple-mental Table S1. Three hundred ninety-fiveE. colistrains were obtained from various sources. Sixty-nine strains were ob-tained from academic hospitals (48 from the Hoˆpital Universi-taire des Enfants Malades Reine Fabiola, Universite´ Libre de Bruxelles, Belgium and 21 from the Academisch Ziekenhuis, Vrije Universiteit Brussel, Belgium). Three hundred six strains were obtained from collections [2 from the Collection de l’Institut Pasteur, (Paris), 130 from the Shiga Toxin-Producing

Escherichia coliCenter (Michigan State University), and 174 from Laboratorio de Referencia deE. coli(Universidad de Santiago de Compostela, Spain)]. Eighteen strains were obtained from stools from healthy volunteers and 2 from urine of patients with a diagnosed cystitis. Identification of these 20 strains was con-firmed using the VITEK 2 (BioMe´rieux, Marcy l’Etoile, France). All the strains, besides those received from LREC, were sero-grouped using the complete serogrouping kit from LREC.E. coli

serogrouping relies on the nature of the O antigen. One hundred seventy-four different serogroups have been described. In addition, the MG1655 (wild-typeE. coliK-12) (Gentry

et al.1991) and the SG22622 (MC4100cpsBTlacZ ara malPT

lacIq) (from S. Gottesman) laboratory strains were used.

Media:Luria–Bertani medium (LB) (Miller1972), Ceria 132 synthetic medium (CM), (Glansdorff 1965), and CM supplemented with 0.1% casamino acids (CCM) were used.

DNA manipulations: Transformations with appropriate plasmids were performed as described in Miller (1972), and most routine DNA manipulations were performed as described in Sambrookand Russell(2001).

PCR detection of theccdO157system:Presence of theccdO157

system was examined in all ourE. coliisolates by PCR, using primers flanking thefolA–apaHintergenic region: primer 40-bis (59-GCAGAACTCTCACAGCTATT-39) complementary to the 39-end of thefolA gene and primer 93 (59-TTGTCCAG CCGTCGAACCGGC-39) complementary to the 39-end of the

to the 59-end of the ccdAO157 gene and primer 47 (59 -AGTCTCTGCAGTTAAATCCCGTCGAGC-39) complemen-tary to the 59-end of theccdBO157gene were used. As an internal control, primers 16SA (59-CCCCCTGGACGAAGACTGAC-39) and 16SB (59-ACCGCTGGCAACAAAGGATA-39) complemen-tary to 16S rRNA were used in PCR reactions.

Sequencing of thefolA–apaHintergenic region:To ensure a diverse sampling of the E. coli population, the folA–apaH

intergenic region of 93 isolates was sequenced using primers 40-bis and 93 (see supplemental Table S1, in boldface type). The sequence of the 712-bp fragment obtained in 47 different serogroups, as well as that of the 1499-bp fragment in 20 different serogroups, and that of the unique 2778-bp fragment was analyzed. The 151-bp fragment was analyzed for the 25 serogroups that presented a high variability in PCR size. In the case of the 712-bp fragments, the DNA sequence was trans-lated and compared to the CcdAO157and CcdBO157protein sequences from theE. coliO157:H7 EDL933 reference strain using BLASTP. For the 1499- and 2778-bp fragments, the ORFs were determined using ORFinder.

Construction of the ccdA and ccdB expression plasmids:

pBAD33-derivative plasmids:The variants of the chromosomally encodedccdBO157gene were amplified from a boiled colony from the various serotypes using the primers 59-CcdBO157-XbaI (59-GCTCTAGAAGGAGGTAGCGATGCAATTTACGG-39) and 39-CcdBO157-PstI (59-AGTCGCTGCAGCTAGAAGCTCCGGT AC-39). The variants of the F-plasmid-encodedccdBFgene were amplified using OLI 70 (59-TCTAGAAGGAGGGTGAAATGCA GTTTAAGG-39) and OLI 71 (59-AGTCGCTGCAGTTATATT CCCCAGAAC-39). The 59-primers (CcdBO157-XbaI and OLI 70) carried a canonical Shine–Dalgarno (SD) sequence (in boldface type). The PCR products were digested withXbaI and

PstI (in italics) and ligated downstream of the PBADpromoter of the pBAD33 vector cut with the same restriction enzymes. The recombinant plasmids were sequenced. The different variants were named according to the serotype of the strain.

pKK223-3-derivative plasmids:The variants of the chromoso-mally encoded ccdAO157 gene were amplified on a boiled colony from the various serotypes using the primers 59-Ccd AO157-EcoRI (59-TTGTGAATTCTATGACTGCAAAACGTACC A-39) and 39-CcdAO157-PstI (59-AGTCTCTGCAGCTAGAAG CTCCGGTACTC-39). The variants of the plasmid-encoded

ccdAFgene were amplified using P502 (59-TTGTGAATTCTAT GAAGCAGCGTATTACAGTGACAG-39) with P516 (59-AGTCT

CTGCAGTCACCAGTC CCTGTTCTC-39). The PCR products Figure1.—PCR detection of theccdO157system in theE. coli

species. TheccdO157system is located between thefolAand the

apaHgene (not on scale). Its presence was detected by PCR using the P40 and P93 primers that are complementary to the ORFs that are flanking theccdO157system. Another set of pri-mers (P43 and P47) complementary to the ccdAO157 and

ccdBO157ORFs was used to detect it at other potential chromo-somal locations in strains that did not carryccdO157between

folAandapaH.

sequenced. The different variants were named according to the serotype of the strain.

Toxicity and antitoxicity plate assays:To test the toxicity of the cloned CcdBO157and CcdBFvariants, the corresponding pBAD33-ccdBconstructs were transformed in MG1655. The resulting transformants were plated on LB plates containing chloramphenicol with or without arabinose (1%). The CcdB variants were considered to be functional (toxic) when trans-formants were able to grow only in the absence of arabinose.

To test the ability of the cloned CcdAO157and CcdAFvariants to counteract the toxicity of CcdBO157and CcdBF, respectively, the corresponding pKK-ccdAconstructs were transformed in MG1655 expressing the referenceccdBO157orccdBFgenes from the pBAD33 vector. The resulting transformants were plated on LB plates containing chloramphenicol and ampicillin with arabinose (1%). Basal expression of ccdA from the pTac