Conclusion et perspectives - Identification du mécanisme de régulation de la protéine β-caténi

Au cours de ces différents travaux de recherche, nous avons pu montrer que FANCC est un régulateur de la β-caténine, via son action sur le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. Il reste cependant des questions en suspens, notamment quant au fait que nous n’avons pas pu montrer une interaction entre FANCC mutant et Axine-1. Notre hypothèse est que l’interaction FANCC mutant-Axine-1 n’est pas directe et que l’extraction protéique pourrait ne pas maintenir le complexe protéique au complet. Par ailleurs, nous avons montré une interaction entre FANCC mutant et APC, mais dans un système d’immunoprécipitation, qui ne donne que très peu d’informations. Il serait très intéressant d’effectuer des immunofluorescences de FANCC, APC et Axine-1. Ces immunofluorescences pourraient, dans un premier temps, nous indiquer la localisation cellulaire de l’interaction de FANCC mutant avec APC. De plus, ces immunofluorescences pourraient nous dire si Axine-1 co-localisent avec FANCC mutant et APC dans un complexe multi-protéique.

Dans ce projet, nous avons montré un défaut d’accumulation de la β-caténine. Notre hypothèse est que la surexpression des protéines du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine induit une hyperphosphorylation de cette protéine. Afin de montrer que la β-caténine se trouve dans un état hyperphosphorylée dans les cellules déficientes en FANCC, il serait intéressant de tester le niveau de phosphorylation de la β-caténine par immunobuvardage entre les cellules dérivées de patients mutantes pour FANCC ou complémentées en FANCC.

Par ailleurs, ce projet nous a aussi apporté un résultat surprenant vis à vis des niveaux d’expression de l’oncogène c-Myc. En effet, on a observé que les fibroblastes dérivés de patients Fanconi, mutés pour FANCC montrent un niveau d’expression de c-Myc plus faible que ces mêmes cellules complémentées en FANCC. De manière surprenante, nous n’avons pas retrouvé cette différence d’expression de c-Myc dans les cellules SCC dérivées de patients mutées pour FANCC et complémentées en FANCC. Nous avons alors émis une hypothèse selon laquelle les fibroblastes, non cancéreux, maintenaient un niveau faible de c- Myc afin de prévenir une transformation cancéreuse. Cette hypothèse implique que si

78 l’expression de c-Myc, dans les cellules mutantes pour FANCC, est augmentée au niveau de l’expression de c-Myc dans les cellules exprimant FANCC, cela favorise la transformation des cellules mutantes. Cette hypothèse est basée sur la fait que c-Myc soit impliqué dans la division cellulaire et la prévention de l’apoptose, ainsi le maintien d’un faible niveau de cette protéine pourrait induire un ralentissement du cycle cellulaire et favoriser l’apoptose en cas de dommage trop important de l’ADN. Afin de confirmer cette hypothèse, il serait intéressant de faire des tests de survie cellulaire, ainsi que des tests mesurant le temps de division cellulaire entre des lignées fibroblastes dérivés de patients mutant pour FANCC (PD331), et complémentés en FANCC (PD331/C) surexprimant ou non l’oncogène c-Myc. De plus, le fait que c-Myc soit autant exprimé dans les cellules SCC dérivées de patients mutantes ou non pour FANCC montrent que cet oncogène pourrait être une cible thérapeutique intéressante. En effet, il a récemment été montré que c-Myc active la transcription du gène

CT120 212, codant pour une protéine transmembranaire impliquée dans deux voix de signalisation pro-oncogène, la voie PI3K/Akt et la voie Ref/Mek/ERK 213. Dans un premier temps, il faudrait confirmer l’expression de la protéine CT120 dans les cellules cancéreuses dérivées de patients Fanconi, par immunobuvardage. Dans un second temps, il serait intéressant de voir les effets d’une sous-expression de cette protéine dans les cellules cancéreuses dérivées de patient. En effet, il a été montré qu’une sous-expression de CT120 promeut l’expression des gènes apoptotiques p53 et caspase 3, et réduit l’expression des gènes de division cellulaire cycline D1 et CD4. Les modulations de l’expression de ces gènes conduit alors à des blocages de cycle cellulaire en G1 et une augmentation de l’apoptose 214_.

De plus, il a déjà été montré que la diminution de l’expression de CT120 induit une perte du pouvoir tumorigène et prolifératif de cellules d’adénocarcinome du poumon humain, quand elles sont transplantées chez des souris présentant une immunodéficience 215. Effectuer des tests de survie des cellules SCC dérivées de patients mutées pour FANCC et complémentées en FANCC, dans lesquelles on ciblerait l’expression de CT120, permettra de définir si cette protéine peut être une bonne cible thérapeutique dans le cadre du traitement des patients Fanconi atteints de SCC.

Au cours de ce projet, nous avons montré que l’expression de DKK1 est régulée par FANCC de manière indirecte, via la régulation de l’oncogène c-Myc. Cependant, il avait déjà été démontré que FANCC a un rôle de répresseur transcriptionnel direct sur DKK1 via son

79 partenaire protéique CtBP-1 99,100_{. Afin de confirmer ces deux mécanismes de régulation}

possibles, et éventuellement déterminer lequel est défectif dans les cellules Fanconi, il serait intéressant de faire des immunoprécipitations de la chromatine de FANCC, CtBP-1 et c-Myc sur le promoteur de DKK1, suivi de séquençage. Ces expériences apporteraient plusieurs informations : la première, cela nous indiquerait la fraction du promoteur de DKK1 impliquée dans la régulation par FANCC. De plus, cela nous permettrait de savoir lequel ou lesquels de ces facteurs de transcription sont, effectivement, localisés sur le promoteur de DKK1 pour permettre sa régulation.

Dans un second temps, nous nous sommes attachés à étudier les mécanismes de régulation de c-Myc par FANCC. Les résultats obtenus ne nous ont pas permis de conclure quant à la localisation de la région du promoteur de c-Myc sur laquelle FANCC et ses partenaires protéiques de régulation pourraient venir se fixer. Afin de déterminer la zone de liaison de FANCC sur le promoteur de c-Myc, il serait intéressant de faire des immunoprécipitations de la chromatine, suivies de séquençage de FANCC sur le promoteur de c-Myc. Cela nous permettrait d’identifier la région d’intérêt. De plus, Il serait possible de récupérer la faction protéique de cette immunoprécipitation et de la faire analyser par spectrométrie de masse. Ces expériences permettraient d’identifier les différents composants du complexe de régulation de c-Myc par FANCC. En effet, à ce jour, aucun motif de liaison à l’ADN n’a été identifié dans la séquence protéique de FANCC, ce qui suggère fortement que FANCC est un cofacteur de transcription devant s’associer à des protéines qui, elles, se lient à l’ADN.

Au cours de ce projet, nous avons effectué des tests préliminaires afin de tester la fonction des motifs NR putatifs de FANCC, présentés en annexe. Pour cela, nous avons utilisé des constructions artificielles qui nous ont permis de tester la réponse à 5 récepteurs hormonaux. Ces résultats préliminaires n’ont pas montré d’activation pour aucune de ces constructions dans les cellules mutantes pour FANCC transfectées avec un FANCC sauvage ou avec des mutants de FANCC. Cependant, il est à noter que ces tests ont été fait dans des cellules cultivées dans un milieu supplémenté en sérum contenant de nombreuses hormones. Il est donc possible que les tests se soient révélés négatifs à cause de la présence de ces

80 hormones. Il serait donc particulièrement utile de confirmer ces résultats dans les mêmes cellules cultivées dans du milieu déprivé en hormones.

Par ailleurs, nous n’avons testé dans ce projet que des simples mutants de FANCC, et il est possible que les motifs NR de FANCC soient redondantes et que la mutation d’un seul de ces motifs ne soit pas suffisant pour induire un effet sur les constructions artificielles des éléments de réponse. Il serait donc intéressant d’effectuer des doubles, des triples et un quadruple mutant des NR afin de déterminer s’il existe une redondance ou si ces motifs NR putatifs ne se lient simplement pas aux récepteurs nucléaires.

De plus, nous n’avons pas effectué de contrôles positifs et négatifs de l’activation de ces constructions. Il est donc possible que ce que nous considérons comme n’étant pas une activation, soit en fait une activation dans toutes les conditions. Il faudrait donc mettre en place des contrôles. Pour l’élément de réponse RARE, en plus de faire ces tests dans des cellules cultivées en absence d’hormones, correspondant au contrôle positif, nous pourrions faire ce test dans ces mêmes cellules traitées à l’acide rétinoïque. Pour l’élément de réponse ERE, nous, pourrions de la même panière effectuer ces tests dans les cellules cultivées en milieu privé d’hormones (contrôle négatif), et dans des cellules traitées aux œstrogènes (contrôle positif). Dans le même ordre, il faudrait tester l’élément de réponse ARE dans des cellules cultivées dans du milieu sans hormones (contrôle négatif) et dans des cellules traitées avec des androgènes (contrôle positif). Du fait de leur implication dans des maladies métaboliques, comme le diabète, il existe des antagonistes des proliférateurs de peroxysomes

216_{. Un traitement des cellules avec ces molécules pourrait donc servir de contrôle négatif}

pour les constructions PPRE et DRE.

Par ailleurs, en plus de leur implication dans des pathologies du métabolisme, il est connu que le traitement prolongé d’animaux avec des activateurs de la prolifération des peroxysomes induit une augmentation du risque de cancers chez les animaux 216_{. Il a}

également été montré que l’un des récepteurs aux activateurs de la prolifération des peroxysomes est régulé par APC 217. Or, nous avons montré que, dans les cellules exprimant un FANCC mutant, il y a une augmentation significative de l’expression d’APC, en comparaison aux cellules exprimant un FANCC sauvage. Il serait donc extrêmement intéressant d’étudier plus attentivement l’expression des récepteurs aux activateurs de la

81 prolifération des peroxysomes dans les cellules mutantes pour FANCC et dans les cellules complémentées en FANCC sauvage.

En conclusion, les résultats de cette thèse ont permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation de la voie Wnt/β-caténine par la protéine FANCC. Ces résultats ont également mis en lumière des indices suggérant un mécanisme de protection des cellules mutantes pour FANCC contre la transformation tumorale. En effet, dans les lignées cellulaires présentant une mutation de FANCC, la perte d’activation de la voie Wnt/β- caténine, aboutissant à la diminution de l’expression des cibles transcriptionnelles de cette voie, pourrait diminuer le risque de transformation tumorale de ces cellules. Cependant, les mutations engendrées par l’instabilité génétique, caractéristique de l’AF, peuvent permettre de passer outre ce mécanisme de protection, par exemple, en réinstaurant un niveau d’expression de l’oncogène c-Myc équivalent dans les cellules mutantes, en comparaison des cellules exprimant un FANCC sauvage. Il serait donc particulièrement intéressant de développer ce point, afin de pouvoir mettre en place des tests de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, comme la protéine CT120, déjà mise en avant comme cible thérapeutique dans le traitement de SCC de la population générale, ainsi que dans le cancer du poumon de la population générale 212,212,214,215.

ANNEXE : Les domaines de liaison aux récepteurs

nucléaires de FANCC

• Introduction

Des analyses de la séquence protéique de FANCC, effectuées au laboratoire, ont permis d’identifier 4 motifs LXXLL dans la séquence protéique de FANCC. Les motifs LXXLL, appelés motifs NR, sont des motifs d’interaction avec des récepteurs nucléaires 218_{. Ces}

récepteurs sont des protéines cytoplasmiques, qui lorsqu’ils interagissent avec leur ligand se relocalisent au noyau pour moduler la transcription de gènes cibles via des cofacteurs de transcription 218_{. Les Nuclear Receptor (NR) sont des récepteurs nucléaires capables de}

répondre à certains signaux hormonaux comme les hormones stéroïdiennes et thyroïdiennes

118_{. Tout d’abord, il existe 4 motifs NR putatifs dans la protéine FANCC, se localisant en C-}

terminal. Le premier que nous appellerons NR-1 se situe entre les positions 422 et 426 (LLWLL), le second, que nous nommerons NR-2, entre les positions 450 et 454 (LGHLL), puis, celui que nous désignons sous le nom NR-3 entre les positions 492 et 496 (LNFLL) et enfin NR-4 entre les positions 550 et 554 (LLKEL). De manière intéressante, plusieurs mutations de FANCC, retrouvées chez des patients, touchent des motifs de liaison à des récepteurs nucléaires hormonaux, comme les mutations FANCCL554P, FANCCL496R et FANCCR548X 117.

Les récepteurs nucléaires sont des protéines principalement cytoplasmiques. Lorsque ces récepteurs reconnaissent leur ligand, il va y avoir une dimérisation de ces récepteurs, un changement de conformation qui va permettre l’exposition d’une séquence de localisation nucléaire. Les complexes vont ainsi pouvoir migrer au noyau et interagir avec des partenaires protéiques afin de moduler la transcription de gènes cibles. Dans la famille des récepteurs nucléaires, il existe plusieurs sous-familles dans lesquelles les récepteurs hormonaux sont classées en groupes. Ici, nous nous sommes particulièrement intéressés à la réponse des récepteurs d’hormones sexuelles, puisque les patients atteints de l’AF montrent des troubles de la fertilité 119_{. Nous nous sommes également intéressé à la réponse à des récepteurs}

83 hormonaux thyroïdiens puisque les patents Fanconi montrent des anomalies dans leur système hormonal 17_.

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription qui permettent l’activation ou la répression de gènes. Nous avons donc émis l’hypothèse que FANCC, via ses motifs NR, interagit avec des récepteurs nucléaires afin de moduler la transcription de gènes. Pour tester cette hypothèse, nous avons effectués des mutations dans les différents motifs NR putatifs de FANCC, puis nous avons effectués des tests de gènes rapporteurs en luciférase avec des constructions artificielles constituées de séquences nucléotidiques capables de lier des récepteurs nucléaires. Chacune des constructions utilisées répond à un récepteur nucléaire spécifiquement. Ces constructions, appelées « élément de réponse » permettent de mesurer l’activation de la transcription des gènes cibles du récepteur à l’acide rétinoïque (Retinoïc Acid Response Element RARA) 219, mais également aux récepteurs aux œstrogènes (Estrogene Response Element ERE) 220, aux récepteurs aux androgènes (Androgen Response Element) 221, aux récepteurs activés par les proliférateurs de péroxysomes (Peroxysome Proliferator-activator receptor Response Element PPRE) 222, et le récepteur au PPARδ (DRE) 217_{. Les récepteurs aux androgènes et aux œstrogènes sont des récepteurs nucléaires}

répondant aux hormones sexuelles mâles et femelles. L’acide rétinoïque est un dérivé de la vitamine A qui est requis pour la croissance cellulaire, en particulier, l’acide rétinoïque, en se liant à son récepteur va moduler la transcription des gène Hox 223_{. Le récepteur de}

prolifération des peroxysomes répond à la liaison de lipides afin d’activer la prolifération des peroxysomes. Les peroxysomes sont des organites cellulaires impliquer dans le catabolisme des acides aminés, des lipides et dans la détoxification des radicaux oxygénés. Enfin, la dernière construction d’élément de réponse que nous avons testé répond au PPAR δ. Ce récepteur nucléaire fait partie de la famille des proliférateur de péroxysome 217. Ce récepteur nucléaire est connu pour être régulé par APC 217, or, nous avons montré dans le chapitre 2 qu’une mutation de FANCC induit une augmentation de la quantité d’APC dans les cellules dérivées de patients, en comparaison à ces cellules exprimant un FANCC sauvage.

• Matériel et Méthode

• Les lignées cellulaires

Dans cette thèse, nous utilisons plusieurs lignées cellulaires provenant d’origine différente. Les fibroblastes dérivées de patients, immortalisés par l’antigène T de SV40, PD331 (portant la mutation R548X du gènes FANCC) et les PD331/C (mêmes cellules que précédemment mais complémentées de manière stable avec un gène FANCC fonctionnel), ces cellules ont été obtenues du Fanconi Anemia Research Fund (Oregon, USA), les fibroblastes dérivées de patients, immortalisés par l’antigène T de SV40, PD20 (portant une mutation dans le gène FANCD2) et les cellules PD20/D2 (complémentées de manière stable avec un gène FANCD2 sauvage et fonctionnel) ont été généreusement donnée par le laboratoire du Dr Markus Grompe (Ordegon, Health & Science University, Portland, Oregon, USA), les fibroblastes dérivés de patients, immortalisés par l’antigène T de SV40, PD220 (portant une mutation sur le gène FANCA) et les PD220/A (complémentées de manière stable avec un FANCA stable et fonctionnel) ont été obtenues du Fanconi Anemia Research Fund (Oregon, USA). Toutes ces lignées cellulaires sont cultivées dans le milieu de culture Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) dans lequel on ajoute 10% de Sérum de veau nouveau-né décomplémenté. Les cellules sont maintenues dans une atmosphère humide à 37°C et 5% de CO2.

• Les constructions plasmidiques

La construction de FANCC en fusion avec un épitope HA (pCMV-Zeo-FANCC) a été précédemment décrite dans l’article 204. Le plasmide pCEP4-FANCCL554P codant pour la protéine FANCC mutante L554P avec un épitope HA a été généreusement offert par le laboratoire du Dr. Maureen Hoatlin (Oregon Health & Science University, Portland, OR). Les plasmides codant pour FANCCL426R, FANCCL454R, FANCCL496R et FANCCR548X ont été générés au laboratoire en utilisant le Quikchange II site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Les plasmides élément de réponse : pARE-lux est un don de Joan Massague et Jeff Wrana (Addgene plasmid #11768) 221_{, 3X ERE TAT luc est un don}

de Donald McDonnell (Addgene plasmide # 11354) 220_{, PLG3-RARE-luciferase est un don}

85 Bruce Spiegelman (Addgene plasmid #1015) 222_{, p4xDRE-luc est un don de Bert Vogelstein}

(Addgene plasmid # 16534) 216_.

• Essais de gènes rapporteurs en luciférase

Les cellules sont transfectées avec des constructions de gènes rapporteurs en luciférase, indiquée dans les figures. De plus, les cellules sont systématiquement transfectées avec un plasmide Rénilla luciférase (Promega, Madisson, WI). La transfection de cette construction nous permet d’avoir un contrôle interne de la quantité de cellules transfectées. Les transfections sont faites avec l’agent de transfection jetPrimeTM (Polyplus transfection, New York, NY) en suivant le protocole du fournisseur. Ce protocole indique que pour des plaques 6 puits (2cm de diamètre), il faut avoir une confluence de cellules entre 70 et 80 %. La transfection est faite avec un mélange de tampon de transfection jetPrime, entre 2 et 3 µg d’ADN et un rapport ADN : jetPrime de 1µg : 2µL. La quantité totale de plasmide est normalisées dans toutes les expériences, par l’utilisation de plasmides vides. Les cellules sont ensuite incubées 4h puis le milieu de culture est changé pour du milieu frais. Les cellules sont lysées et analysées 48h après la transfection. La lyse cellulaire se fait avec le tampon de lyse passive fourni par le kit Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). Les échantillons sont ensuite testés pour leur activité luciférase en utilisant le Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega), en suivant les recommandations du fournisseur. La lecture des plaques est faite par un lecteur de plaque (Tecan Infinite 200, Tecan, Morisville, NC) et l’activité luciférase est normalisée grâce au contrôle Rénilla et exprimée en moyenne relative normalisée à l’expression de la condition contrôle ± SEM. L’ensemble des mesures sont effectuées en duplicata.

• Analyses statistiques

Les données sont exprimées en moyennes ± SEM. Les analyses statistiques sont faites en utilisant le logiciel GraphPad Prism version 6.0, et des t-test avec ou sans liaison sont effectués pour comparer les moyennes. Une valeur de p<0,05 est considérée comme significative.

• Résultats

• Identification des motifs NR putatifs de FANCC

Les domaines NR putatifs de FANCC sont NR-1, qui se localise entre les position 422 et 426 (LLWLL), NR-2, se localise entre les positions 450 et 454 (LGHLL), NR-3 se localise entre les positions 492 et 496 (LNFLL) et, NR-4 se localise entre les positions 550 et 554 (LLKEL) (Figure 4.1). Sachant que les patients Fanconi ont des défauts hormonaux, et que 3 des mutations de patients touchent ces domaines NR putatifs (FANCCL496R, FANCCL554P, et FANCCR548X), nous nous sommes intéressés à savoir si ces séquences NR putatives ont réellement un rôle dans la régulation transcriptionnelle de gènes cibles de récepteurs hormonaux. Pour cela, nous avons utilisé des constructions artificielles de gènes rapporteur en luciférase qui répondent à certains récepteurs hormonaux.

87 Figure Annexe 1 : Séquence protéique de FANCC

Séquence protéique en acides aminées de FANCC. Les 4 motifs de liaison NR sont indiqués en rouge, pour NR-1 qui se localise entre les acides aminés 422 et 426, en bleu

Dans le document Identification du mécanisme de régulation de la protéine β-caténine par la protéine Fanconi-C (Page 95-110)