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CHAPITRE 5 : IMPACT DES OPÉRATIONS DE CONCENTRATION À DIFFÉRENTES ÉCHELLES SUR LES

5.1 Résultats

5.1.1 Compression osmotique

Des expériences de compression osmotique à l’équilibre thermodynamique ont été effectuées et les diagrammes d’état obtenus pour les des deux mélanges sont présentés sur la Figure 60.

On comprime les agrégats du mélange 1 à différentes pressions. Les agrégats comprimés à une pression de 0,2 bar atteignent une concentration de 0,087 g.mL-1. Pour une pression imposée inférieure à 0,6 bar, l’échantillon reste peu visqueux et se concentre jusqu’à 0,198 g.mL-1 (Tableau 21). A des pressions plus élevées, l’échantillon devient plus visqueux, puis gélifie à partir de 1 bar et d’une concentration de 0,269 g.mL-1 tout en restant transparent. Les agrégats comprimés à 5 bar (zone gélifiée) puis décomprimés à 0,2 bar atteignent une concentration de 0,188 g.mL-1 et se séparent en deux phases, l’une liquide et contenant des protéines solubles, et l’autre solide.

Figure 61 : Diagramme d’état obtenu en compression osmotique pour les agrégats du mélange 1 (A) et du mélange 2 (B). Les flèches symbolisent les décompressions. En vert, échantillons liquide, en orange, échantillon visqueux et en rouge, échantillon gélifié.

A B

Tableau 21 : Valeurs caractéristiques du diagramme d’état présenté sur la Figure 59 pour les mélanges 1 et 2. Echantillon Compression imposée (bar) Concentration massique (g/mL) Etat de l’échantillon Décompression imposée (bar) Concentration massique (g/mL) État de l’échantillon M él ange 1 5 0,492 Gélifié 0,2 0,188 2 Phases : solide et liquide 1 0,269 Gélifié 0,6 0,198 Visqueux 0,2 0,087 Liquide M él ange 2 5 0,335 Gélifié 0,1 0,076 2 phases : solide et liquide 1 0,205 Gélifié 0,6 0,152 Visqueux 0,1 0,061 Liquide

Ces deux phases, liquide et solide, ont été passées séparément en A4F et leur profil d’élution est présenté sur la Figure 61A, en comparaison d’un échantillon avant compression osmotique. On observe que la partie ressolubilisée est composée d’une seule population majoritaire éluée entre 10 et 15 min qui correspond au pic des protéines non agrégées et caséines. La partie non ressolubilisée en compression osmotique est en partie remise en solution par agitation mécanique dans de l’eau milliQ, puis filtrée. Le filtrat est enfin analysé en A4F : on retrouve dans ce filtrat les populations correspondant aux agrégats également présents dans l’échantillon avant compression osmotique

(Figure 61A).

Figure 62 : (A) Elugrammes d’A4F des solutions d’agrégats du mélange 1 avant compression osmotique (trait plein), des échantillons de la phase solide obtenue après décompression osmotique (tirets) et de la phase liquide obtenue après décompression osmotique (pointillés) ; (B) Facteur de forme des échantillons avant compression osmotique (X) et des échantillons de la phase solide obtenue après décompression osmotique (o).

B A

Le facteur de forme de la partie non ressolubilisée est également présenté (Figure 61B) : il apparait en moyenne plus élevé que le facteur de forme de l’échantillon avant compression osmotique, mis en comparaison sur cette même figure pour des temps d’élution compris entre 40 et 60 min.

De même, les agrégats du mélange 2 ont été comprimés à différentes pressions (Tableau 21 et Figure 60B). On peut distinguer ici les mêmes étapes que pour les agrégats du mélange 1 : aux faibles pressions inférieures à 0,6 bar, l’échantillon reste peu visqueux et se concentre jusqu’à 0,152 g.mL-1. La transition de gélification est observée à des pressions et concentrations plus élevées (à partir de 1 bar et 0,205 g.mL-1, respectivement), l’échantillon restant transparent. Enfin, les agrégats comprimés à 5 bar (zone gélifiée) puis décomprimés à 0,1 bar atteignent une concentration de 0,076 g.mL-1 et se séparent en deux phases, l’une liquide et l’autre solide.

5.1.2 Ultrafiltration

Des agrégats du mélange 1 et du mélange 2 ont été concentrés par ultrafiltration à des facteurs de réduction volumique allant jusqu’à la gélification du concentré (Tableau 22). Les agrégats du mélange 1 ont commencé à gélifier à partir de 0,216 g.mL-1 tandis que les agrégats du mélange 2 ont gélifié dès 0,180 g.mL-1.

Tableau 22 : Impact de la concentration par ultrafiltration sur la gélification des agrégats des différents mélanges

Concentration en UF

(g.mL-1) FRV

État de l’échantillon en sortir d’UF

Mélange 1

0,052 1 Liquide 0,102 2 Liquide 0,155 3 Liquide 0,213 4 Liquide 0,216 > 4 Gélifié

Mélange 2

0,064 1 Liquide 0,122 2 Liquide 0,180 3 Gélifié

Ensuite, des échantillons du mélange 1 ont été redispersés à leur concentration initiale juste après ultrafiltration pour évaluer si cette étape de concentration avait un impact direct sur les propriétés intrinsèques des agrégats. Le profil A4F de ces solutions concentrées et redispersées ainsi que les facteurs de forme associés sont présenté Figure 62. Les mêmes profils sont observés pour chacun des

échantillons en termes de temps d’élution, de rayon de giration et de facteur de forme. En ce qui concerne le mélange 2, les agrégats du rétentat concentrés à 120 g.L-1n’ont pas pu être analysés en A4F après redispersion à cause d’une gélification à J+7.

Figure 63 : (A) Elugramme d’A4F et (B) facteur de forme des agrégats du mélange 1 concentrés à différents FRV puis redispersés. Les agrégats du mélange 1 ont été produits à 50g.L-1 de protéine, 10mM de NaCl, pH 7, à Re 6900, RTh 7s et à 85°C.

B A

5.1.3 Séchage par pulvérisation

Les agrégats des deux mélanges ont également été séchés par pulvérisation. Les profils d’A4F et de facteur de forme des échantillons du mélange 1 avant et après séchage sont présentés sur la Figure 63. On observe les mêmes profils d’élution, de rayon de giration (Rgmoy ≈ 310 nm) et de facteur de forme qui varie de 0,6 à 1,2.

Les mêmes profils d’élution, de Rg et de facteur de forme sont observés quel que soit le niveau de concentration (FRV1, FRV2, FRV3 ou FRV4) avant séchage (Résultats non montrés).

Figure 64 : (A) Elugrammes d’A4F et (B) facteur de forme des agrégats du mélange 1 avant et après séchage, après redispersion par homogénéisation. Les agrégats du mélange 1 ont été produits À 50g.L-1 de protéine, 10mM de NaCl, pH 7, à Re 6900, RTh 7s et à 85°C. Les traits rouge et vert représentent respectivement les Rg/Rh théorique de sphère et agrégats branchés.

B A

Les profils d’A4F et de facteur de forme des échantillons du mélange 2 avant et après séchage sont présentés sur la Figure 64. On observe une augmentation de Rg (Rgmoy = 183 nm avant séchage et Rgmoy

= 250 nm après séchage) à des temps d’élution compris entre 35 et 50 min d’élution pour les échantillons ayant subi l’étape de séchage. De même le facteur de forme est plus élevé entre 35 et 45 min d’élution pour les échantillons ayant subi une étape de séchage. Le facteur de forme aux temps d’élution de 25 à 40 min varie de 0,8 à 1,8 pour les échantillons avant séchage et de 0,8 à 2,3 pour les échantillons après séchage.