Chromatographie d’interaction hydrophobe

A l’issue de la première étape de purification par échange d’ions, les fractions contenant la laccase B ont été purifiées par chromatographie d’interaction hydrophobe (Hytrap Phenyl HP, 1 mL, Pharmacia). La colonne est équilibrée avec 5 mL de solution de sulfate d’ammonium (SA) à 30 % (w/v). 2 ou 3 mL de la solution contenant la laccase B diluée deux fois dans une solution de SA à 60 % sont déposés sur la colonne (la purification sur colonne d’interaction des 5 mL de laccase obtenus à l’issue de la purification par chromatographie d’échange d’anions a été réalisée en deux fois). Les protéines non retenues sont ensuite éluées avec 5 mL de SA à 30% puis la laccase B est éluée avec successivement 5 mL de SA à 20 % puis 5 mL de SA à 10%. L’activité des différentes fractions collectées en sortie de colonne est mesurée afin de

53 repérer les fractions contenant la laccase. La Figure II.2 montre les activités des différentes fractions récupérées.

Figure II.2: Activité des fractions collectées à la sortie de la colonne de chromatographie d’interaction hydrophobe pour un volume de laccase introduit de 2 mL (à gauche) et 3 mL (à

droite)

Une fois collectées, les solutions contenant l’enzyme sont regroupées, dialysées et concentrées dans un tampon phosphate citrate 50 mM à pH 5 afin d’éliminer le SA puis dans un tampon phosphate à pH 7 pour conservation à -20°C. Du glycérol 15 % (w/v) est ajouté aussi avant congélation de l’échantillon. Le résumé des quantités de laccase purifiées après chaque étape est donné dans le Tableau II.2. Le rendement est calculé par rapport au milieu de culture.

Tableau II.2: Récapitulatif des quantités de laccase produites et purifiées Solution de laccase Volume

Purification de la laccase par chromatographie échangeuse d’ions

Laccase A (pic 1) 20 51,1 1022,6 30

Purification de la laccase par chromatographie hydrophobe

Laccase B conditionnée 7,5 401,5 3011,3

0 2 4 6 8 10 12 14 16

54 La perte d’activité de la laccase A entre l’étape d’élution et celle de concentration/dialyse pourrait s’expliquer par le fait que quelques jours se sont écoulés entre l’étape de purification et l’étape de concentration ou par le fait qu’une portion de laccase a été perdue lors de l’étape de lavage de la membrane d’ultrafiltration. L’augmentation de l’activité de la laccase B après dialyse pourrait etre expliqué par le fait que les ions chlorures qui inhibent l’activité de la laccase on été retirés par ultrafiltration.

La solution de laccase B purifiée et concentrée est finalement analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide formé par réticulation d’un mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide. Plus le pourcentage de ce dernier est élevé, plus la densité de chaines sera élevée et plus les mailles du réseau seront serrées et en conséquence plus les protéines seront ralenties.

Leur vitesse de déplacement sous l’effet d’un champ électrique dépend en effet à la fois de leur charge et de leur taille. On utilise un gel à 11,5 %, dont la composition est décrite dans le Tableau II.3. Un volume d’échantillon à 401,5 U/mL est déposé dans chaque puits. Les échantillons déposés ne contiennent pas de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et n’ont pas subi de traitement thermique à 100°C afin de conserver intacte l’activité des protéines.

Tableau II.3: Composition des milieux pour la réalisation de l’électrophorèse Gel de résolution (quantité pour une plaque) à 11,5 % Acryl acryl bis (solution commerciale à 40 %) 1,43 mL Tampon A (Tris/HCl à 226,9 g/L, pH 8,9): Gel de stacking à 4 % (quantité pour une plaque)

Acryl acryl bis 0,3 mL

On a réalisé deux gels sur lesquels on a déposé les mêmes échantillons. Sur le premier gel, on révèle la présence de protéines après migration avec du nitrate d’argent tandis que l’activité

55 laccase est détectée sur le second par imprégnation dans une solution de guaïcol, un substrat de la laccase qui produit une quinone colorée en présence de laccase. (Figure II.3).

Figure II.3: Electrophorèse sur gel après révélation au nitrate d’argent (puits 1 à 6) et au guaïcol (puits 7 à 10)

Les puits 1 et 6 contiennent des marqueurs de masse moléculaire

Les puits 2 et 7 contiennent les surnageants de culture après concentration et dialyse Les puits 3 et 8 contiennent la laccase A après échange d’anion

Les puits 4 et 9 contiennent la laccase B après échange d’anion Les puits 5 et 10 contiennent la laccase X après échange d’anion

Les laccases A et B ont des masses moléculaires similaires de l’ordre de 60 kDa. Or on observe, et cette constatation est reportée également dans la littérature sans qu’il soit donné d’explication, que les laccases A et B migrent à des masses molaires différentes, respectivement 100 et 45 kDa. Il est à noter toutefois que lorsqu’on chauffe les échantillons à 100°C avant de les déposer sur le gel d’électrophorèse, les deux protéines migrent à la masse attendue, soit 60 kD. Cette « anomalie » de migration peut s’expliquer par le fait que le tampon de préparation de l’échantillon ne contient pas de SDS. La protéine migre donc non seulement en fonction de son poids moléculaire mais également de sa charge. Dans les conditions expérimentales utilisées ici, on observe que la protéine majoritaire du surnageant de culture (puits 2) est la laccase B. La fraction non retenue par chromatographie par échange d’ions contient majoritairement de la laccase A, ainsi que de nombreuses autres protéines. Par coloration au

45 kDa 66 kDa 97 kDa 116 kDa

56 guaïcol, on ne détecte pas la présence de laccase B. Le puits 4 contient la laccase B purifiée.

On peut estimer la pureté de la laccase à au moins 95 % sur la base de l’intensité des bandes.

On a aussi essayé de produire sans réussite dans la levure Yarrowia lipolytica des laccases recombinantes mutées. Le protocole de production est décrit en annexe (Annexe 1).