Le développement des biopiles enzymatiques s’accompagne de la recherche de conditions optimales de fonctionnement. Outre le choix du biocatalyseur, la maîtrise du transfert d’électron entre l’enzyme et l’électrode d’une part, et l’élaboration de matériaux d’électrode avec une surface spécifique élevée d’autre part, constituent deux voies de recherche majeures pour le développement des biopiles, auxquelles on peut rajouter leur durée de vie et leur puissance, deux critères qui ne seront pas abordés dans ce travail.
Durant ces dernières années, une attention particulière s’est portée sur l’implication des nanotubes de carbone. Ces matériaux, en plus d’être biocompatibles, offrent une excellente conductivité électronique et une grande surface spécifique permettant ainsi d’immobiliser une grande quantité d’enzyme. Il est également nécessaire d’assurer une bonne communication entre le biocatalyseur et l’électrode car les performances d’une biopile enzymatique dépendent fortement du transfert d’électrons entre ces deux entités. Dans ce travail, on s’intéresse aux biopiles fonctionnant par transfert d’électrons direct entre l’enzyme et son support solide. Ce dernier doit donc offrir une topographie et une chimie de surface idéales pour les enzymes afin de garantir leur connexion électronique, une activité bioélectrocatalytique efficace et une grande stabilité dans le temps. Selon la nature de l’immobilisation (greffage covalent, interactions électrostatiques), l’orientation de l’enzyme est contrôlée par la position des groupements fonctionnels pouvant intervenir dans l’immobilisation de l’enzyme. Par exemple, la présence d’acides aminés proches du site actif permet une orientation favorable où la distance
43 entre le site actif de l’enzyme et l’électrode est minimale. Dans ce contexte, notre objectif est de développer de nouvelles architectures de biocathodes utilisant comme enzyme la laccase de Trametes versicolor afin d’optimiser son activité bioélectrocatalytique envers la réduction de l’oxygène. D’une part, on propose ici pour la première fois l’implication du nitrure de carbone amorphe dans la réalisation de telles biocathodes. L’objectif est ici d’approfondir la maîtrise et la compréhension de l’impact de l’orientation des enzymes greffées sur le transfert électronique direct enzyme-électrode et donc sur les propriétés bioélectrocatalytiques des enzymes greffées envers la réaction de réduction de l’oxygène (ORR). Selon nous, cette proposition repose d’une part sur la chimie de surface de cette famille de matériaux conducteurs électroniques parfaitement adaptée au greffage d’enzyme, ainsi que sur sa topographie extrêmement lisse qui donne accès à des techniques expérimentales incompatibles avec des bioélectrodes nanostructurées. Précisons ici que des biocathodes graphite/a-CNx/laccase ont été développées, en parallèle de biocathodes Si/a-CNx/laccase initialement pressenties dans cette partie de notre étude, car ces dernières ne produisent aucun courant cathodique détectable pour l’ORR dans nos conditions expérimentales. D’autre part, on présente également, et là-encore pour la première fois, la nanostructuration de biocathodes à l’aide de nanowalls de carbone (CNWs).
Nous espérons ainsi cumuler la très grande surface spécifique ainsi produite avec une bonne maîtrise de l’orientation des enzymes greffées issue de nos observations acquises sur a-CNx dans la perspective d’obtenir des densités de courant très compétitives par rapport à celles publiées dans la littérature. Grâce à l’expertise pour cette technique développée au laboratoire, on envisage également d’étudier l'orientation et la cinétique de greffage de l'enzyme en utilisant la technique PM-IRRAS en réalisant l’analyse post-immobilisation de l’enzyme sur le support mais également pendant l’immobilisation, c’est-à-dire in situ en phase liquide donc dans des conditions les plus proches possibles des conditions réelles. Plusieurs études ont été effectuées pour étudier l’orientation de l’enzyme notamment la bilirubine oxydase en utilisant cette technique de caractérisation mais aucune n’a été faite en phase liquide en étudiant la cinétique d’immobilisation de la laccase concomitamment aux mesures PM-IRRAS (étude in situ).
L’objectif ici est non seulement d’étudier l’orientation de la laccase sur les surfaces d’or en effectuant une étude in situ et ex situ mais aussi d’évaluer le temps de greffage.
Le premier type de matériau développé au cours de ce travail est le nitrure de carbone amorphe déposé sous forme de couche mince sur graphite. Les premières tentatives de synthèse
44 de ces couches remontent à 1979 par Cuomo et al. [1]. Ce type de matériau appartient à la famille des « Diamond-like carbon » (DLC). Les DLCs constituent des formes métastables de carbone amorphe. Ils sont constitués d’atomes de carbones hybridés sp2 (de type graphite) et sp3 (de type diamant). La structure peut être décrite comme un réseau amorphe plus ou moins hydrogéné d’atomes de carbone liés de façon covalente sous différentes hybridations. Les propriétés des DLCs dépendent donc de la proportion en carbone sp2/sp3 et de la quantité d’hydrogène. On distingue les carbones amorphes notés a-C et a-C : H. Ils sont essentiellement composés d’atomes de carbone ayant une hybridation sp2. La deuxième famille est celle des carbones amorphes tétraédriques (ta-C et ta-C : H). Ils sont essentiellement constitués d’atomes de carbone en configuration sp3 [79]. L’incorporation d’azote dans les carbones amorphes permet au carbone d’établir différents types de liaison chimique. Plusieurs méthodes ont été employées pour déposer les films de nitrure de carbone amorphe. Il s’agit essentiellement de techniques de dépôt sous vide (dépôts physiques en phase vapeur, dépôts chimiques en phase vapeur assistés par plasma). Les a-CNx ainsi formés constituent une famille de matériau dont les propriétés sont diverses. On a choisi de travailler avec ce matériau en raison de ses propriétés électrochimiques intéressantes. Il offre une fenêtre de potentiel, une conductivité électronique et une réactivité électrochimique qui sont modulables en fonction du contenu en azote atomique de ces matériaux. Il possède aussi la particularité de présenter en surface des groupements amines produits naturellement au cours de son exposition à l’air immédiatement après la phase de dépôt, ce qui permettra le greffage d’enzymes à sa surface [80] sans étape préalable de fonctionnalisation de surface.
Le deuxième type de matériau envisagé, les CNWs, permet de nanostructurer la surface de l’électrode. Il s’organise sous la forme d’un empilement de feuillets de graphène en position verticale sur le substrat sur lequel ils sont déposés [81]. Contrairement au nitrure de carbone amorphe, les nanowalls de carbone comme les nanotubes de carbones, permettent d’augmenter considérablement la surface spécifique de l’électrode, mais ils ne présentent aucun groupement fonctionnel. Au cours de ces dernières années, plusieurs procédés de synthèse des nanowalls ont été étudiés (décharge micro-onde en utilisant comme gaz un mélange de CH4/H2 [82-84], plasma généré par radiofréquence [84], décharge électrique en courant continue en utilisant comme gaz un mélange CH4/H2/Ar [85], dépôt chimique en phase vapeur à haute fréquence 9en utilisant un CH4/H2/Ar [86]). On a utilisé dans ce travail pour la formation de nanowalls de
45 carbone par dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma à excitation micro-onde (PECVD) en utilisant comme gaz plasmagène un mélange de monoxyde de carbone (CO) et de dihydrogène (H2). L’objectif est de transposer sur ce nouveau matériau (nanowalls de carbone) la méthode de fonctionnalisation de surface par plasma à la pression atmosphérique précédemment développée et utilisée sur du graphite au sein du laboratoire [3], en procédant à l’identification et à l’optimisation, à l’aide de plans d’expérience, des paramètres déterminants de traitement plasma. Nous exploiterons également les conclusions obtenues sur a-CNx et liées à l’optimisation du transfert électronique direct entre les enzymes greffées et leur support carboné dans l’objectif d’obtenir des densités de courants élevées pour l’ORR.
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Chapitre II.Matériels et méthodes
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