Chez la levure - : L’architecture nucléaire

Chapitre IV : L’architecture nucléaire

D. Chez la levure

a. La conformation « Rabl-like » des chromosomes

Comme énoncé précédemment, Carl Rabl a postulé en 1885 que la disposition des chromosomes dans le noyau des cellules de salamandre était conservée entre la mitose et l’interphase. En d’autres termes, suite au désassemblage du fuseau mitotique les centromères des chromosomes restent regroupés à un pôle de la cellule alors que les bras des chromosomes s’étendent vers le pôle opposé ((Rabl, 1885), Figure 39). Une telle organisation des chromosomes (appelée organisation en Rabl) peut être observée dans une grande variété de cellules de plantes, de drosophile, de levures dont S. cerevisiae et S. pombe et dans certaines cellules de mammifères (Abranches et al., 1998; Cremer et al., 1982; Foe and Alberts, 1985; Funabiki et al., 1993;

Hochstrasser et al., 1986; Jin et al., 2000; Sperling and L dtke, 1981). L’organisation des chromosomes en Rabl n’est pas antinomique avec celle des territoires chromosomiques puisque comme nous allons le voir par la suite, les chromosomes chez la levure établissent préférentiellement des contacts intra-chromosomiques, suggérant que chaque chromosome occupe un territoire qui lui est propre (Dekker et al., 2002; Duan et al., 2010; Sexton et al., 2012). Chez les levures S. cerevisiae comme S. pombe, l’organisation des chromosomes dans le noyau dépend de trois éléments : les centromères, les télomères et le nucléole.

i. Les centromères

Comme prédit par la conformation Rabl, les centromères sont regroupés à un pôle de la cellule de levure. Ils sont connectés à l’enveloppe nucléaire par l’intermédiaire de microtubules émanant du centre organisateur des microtubules et liés aux kinétochores (Bystricky et al., 2004;

Guacci et al., 1994; Jin et al., 1998, 2000). Chez la levure S. cerevisiae, les kinétochores sont de larges complexes protéiques de plusieurs mégadalton, composés de plus de 45 protéines différentes et mesurant 120 nm de long (pour revue (Biggins, 2013), Figure 39 encart bleu). On distingue le kinétochore interne, qui comprend les sous-unités en contact avec le nucléosome centromérique caractérisé par la présence du variant d’histones Cse4, du kinétochore externe qui est, lui, composé des sous-unités en lien avec les microtubules. En plus d’ancrer les chromosomes à l’enveloppe nucléaire, les kinétochores jouent un rôle majeur lors de la mitose. En effet, ils agissent comme une plateforme permettant la détection des défauts d’attachement entre les centromères et les microtubules, le signalement de ces défauts et la mise en place du point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique (Biggins, 2013). On peut noter que chez la levure à bourgeon chaque kinétochore est lié par un unique microtubule (Winey et al., 1995). Le centre organisateur des microtubules, appelé « Spindle Pole Body » (SPB) chez la levure est ancré dans l’enveloppe nucléaire tout au long du cycle cellulaire ((Robinow and Marak, 1966), Figure 39 encart violet).

C’est un complexe protéique de 500 MDa, mesurant en mitose 120 nm de long sur 150 nm de large (Byers and Goetsch, 1974). Il n’est cependant composé que de 18 protéines différentes qui sont donc présentes en grands nombres dans ce complexe (Rüthnick and Schiebel, 2018). De par son ancrage à l’enveloppe nucléaire, le SPB est en contact à la fois avec le cytosquelette cytoplasmique et avec les microtubules nucléaires ; il est donc un vecteur de la communication entre le cytoplasme et le noyau des cellules. Le SPB a un rôle essentiel dans l’organisation des chromosomes tout au long du cycle cellulaire : en interphase, il permet l’ancrage et le regroupement des centromères à un pôle de la cellule et en mitose, il initie la formation du fuseau mitotique (pour revue (Rüthnick and Schiebel, 2018)). Ainsi les chromosomes sont maintenus par le SPB dans une organisation de type Rabl. L’organisation des chromosomes dans le noyau interphasique ne résulte donc pas uniquement de l’organisation des chromosomes en mitose comme le suggérait Rabl (Jin et al., 2000). Pour cette raison, on fait référence à une conformation « Rabl-like » dans les organismes où les centromères sont connectés au SPB.

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ii. Les télomères

L’organisation des chromosomes chez la levure dépend également des télomères. Les télomères se situent à l’extrémité de chaque bras chromosomique et sont caractérisés chez la levure S. cerevisiae par la répétition de la courte séquence TG1-3 sur 250-300 pb (Shampay et al., 1984).

Les séquences sub-télomériques sont, elles, plus grandes (environ 7 kb) et sont composées de répétitions d’éléments génétiques tels que les éléments X et Y’ (Horowitz et al., 1984; Walmsley et al., 1984). Comme abordé dans le Chapitre I de cette introduction, des protéines telles que Rap1 ou les histones déacétylases de la famille des Sirtuines Sir2, Sir3 et Sir4 se lient aux télomères et instaurent un état chromatinien fermé (pour revue (Taddei and Gasser, 2012)). De plus, et en accord avec leur état chromatinien réprimé, les télomères sont répliqués en fin de phase S (Raghuraman et al., 2001).

L’organisation des télomères dans le noyau des cellules a été initialement sondée par FISH (Gotta et al., 1996), puis en cellules vivantes par le système FROS ((Bystricky et al., 2005), voir plus haut, Figure 24). Ces études ont révélé que les télomères s’organisaient en foyers, à la périphérie du noyau. En effet, alors que chaque cellule contient 32 télomères répartis sur 16 chromosomes, seule une dizaine de foyers télomériques est visible par FISH (Gotta et al., 1996).

Chaque foyer contiendrait donc en moyenne trois télomères. Le regroupement des télomères au sein d’un foyer n’est pas aléatoire : les télomères des bras courts (<300 kb) des chromosomes ont tendance à se regrouper entre eux, à proximité du SPB alors que les télomères des bras longs (>300 kb) sont plus fréquemment associés, à distance du SPB (Therizols et al., 2010). Ainsi le centromère et les télomères de chaque chromosome sont ancrés à l’enveloppe nucléaire. L’ancrage des télomères à l’enveloppe est un mécanisme complexe qui dépend du cycle cellulaire et qui fait intervenir de nombreux acteurs protéiques. Par exemple, la protéine Sir4 semble être associée à la protéine membranaire Esc1 au cours des phases G1 et S alors que les interactions entre la protéine membranaire Mps3 et Sir4 et entre Mps3 et la sous-unité de la télomérase Est1 semblent être spécifiques de la phase S (pour revue (Taddei and Gasser, 2012), Figure 39 encart vert).

iii. Le nucléole

Un dernier élément architectural du noyau de levure est le nucléole. Ce corps nucléaire, non délimité du nucléoplasme par une membrane, a une forme caractéristique de croissant. Il est situé à la périphérie du noyau, diamétralement opposé au SPB ((Bystricky et al., 2005; Yang et al., 1989),

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Figure 39) et occupe un tiers du volume nucléaire (Uchida et al., 2011). Le nucléole est le site de la biogénèse des ribosomes (voir plus bas). De par sa forte concentration en acides nucléiques et en protéines le nucléole apparaît dense aux électrons après coloration aux métaux lourds et visualisation en microscopie électronique. Il a ainsi été montré que le nucléole était formé de trois sous-compartiments : le centre fibrillaire (FC), le composant fibrillaire dense (DFC) et le composant granulaire (GC) ((Schwarzacher and Wachtler, 1991), Figure 8c). Chez les métazoaires, le FC serait un lieu de stockage pour des facteurs protéiques tels que la Pol I et pour les gènes d’ADN ribosomique (ADNr). La transcription de ces derniers aurait lieu à l’interface entre le FC et DFC. Les premières étapes de maturation des ARN ribosomiques (ARNr) se feraient dans le DFC alors que le GC contiendrait des particules plus matures. Alors que le DFC et le GC sont clairement visualisables dans des coupes de nucléole de S. cerevisiae observées en MET, la présence du FC dans cet organisme est matière à débat. Les FC ont pu être observés chez S.

cerevisiae (Léger-Silvestre et al., 1999) cependant leur détection n’est pas aussi aisée que dans les cellules de mammifères et elle semble dépendre du fond génétique de la cellule observée. Cela a conduit à définir une structure bipartite du nucléole dans cet organisme, comprenant d’une part le GC et d’autre part le FC/DFC (Thiry and Lafontaine, 2005).

Depuis la découverte de ce corps nucléaire isolé du reste de la chromatine, de nombreux laboratoires ont cherché à comprendre quel était le mécanisme de formation du nucléole. Il est apparu que la morphologie du nucléole corrélait avec le niveau de transcription par la Pol I. En effet, lorsque cette dernière est inhibée le nucléole des cellules de levures apparaît compacté et son volume est réduit (Mostofa et al., 2018; Tsang et al., 2003). Au contraire, le nucléole semble occuper un volume plus important dans les cellules cancéreuses où la biogénèse des ribosomes est stimulée (Drygin et al., 2010). Par ailleurs, il a été montré que certaines protéines impliquées dans la maturation des ARNr montraient des propriétés de séparation de phase ((Feric et al., 2016), Figure 33b). Cela pourrait expliquer pourquoi le nucléole forme un corps nucléaire qui n’interagit que peu avec le reste de la chromatine.

Dans les cellules de mammifères, certaines séquences chromatiniennes interagissent avec la périphérie du nucléole. Ces séquences ont été nommées NADs pour « Nucleolar-Associated Regions » ; elles sont réprimées transcriptionnellement et pauvres en gènes (van Koningsbruggen et al., 2010; Németh et al., 2010; Quinodoz et al., 2018). Chez S. cerevisiae, le nucléole contribue également à l’organisation des chromosomes puisqu’il a été montré que certains gènes transcrits

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par l’ARN polymérase III (Pol III) étaient préférentiellement recrutés à l’interface entre le nucléole et le nucléoplasme lors de leur transcription (Belagal et al., 2016).

iv. L’enveloppe et les pores nucléaires

En plus des trois éléments cités ci-dessus, l’enveloppe et les pores nucléaires influencent également le positionnement des chromosomes au sein du noyau. L’enveloppe nucléaire est constituée d’une double bicouche lipidique. Sa membrane externe, en continuité avec le réticulum endoplasmique, est en contact avec le cytoplasme alors que sa membrane interne fait face à l’intérieur du noyau. Les deux membranes sont séparées par un espace inter-membranaire mais fusionnent localement au niveau des pores nucléaires (pour revue (Taddei and Gasser, 2012)). Les pores nucléaires ou NPC (pour « Nuclear Pore Complexes ») sont des complexes protéiques de 50 MDa composés de 30 protéines différentes (les nucléoporines), toutes présentes dans le complexe selon un multiple de 8 (Kim et al., 2018; Rout et al., 2000). Chaque NPC est composé d’un anneau central et de deux anneaux, un externe et un interne d’où émanent des filaments protéiques flexibles, en direction du cytoplasme et du noyau respectivement (Alber et al., 2007). La fonction première des NPCs est de permettre le transport et l’échange entre le cytoplasme et le noyau des ARNs et des protéines. La face nucléaire des NPCs peut également s’associer avec la chromatine active en transcription ((Casolari et al., 2004), Figure 39 encart orange). Cette association stimulerait la transcription des gènes et permettrait de faciliter l’export des ARN messagers produits vers le cytoplasme ((Blobel, 1985) pour revue (Dieppois and Stutz, 2010)). Ce type d’interaction a notamment été observé lors de l’activation des gènes Gal : l’ajout de galactose dans le milieu a provoqué l’activation de la transcription de ces gènes et leur relocalisation à proximité des NPCs (Cabal et al., 2006; Taddei et al., 2006). Cependant la relocalisation des gènes aux NPCs n’est pas requise pour leur transcription et tous les gènes n’y sont pas recrutés lors de leur activation (Cabal et al., 2006).

En revanche, l’enveloppe nucléaire située à distance des NPCs représente un environnement répressif pour la transcription. En effet, la mise en silence d’un gène rapporteur induit sa relocalisation en périphérie du noyau et l’abolition de l’interaction entre les télomères et l’enveloppe nucléaire provoque l’activation de la transcription des gènes présents dans les séquences sub-télomériques ((Andrulis et al., 1998; Feuerbach et al., 2002), Figure 39 encart orange)

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Les chromosomes de levure sont donc organisés autour d’éléments architecturaux que sont

Après l’étude de Dekker de l’organisation du chromosome III par technique de 3C (Dekker et al., 2002), l’organisation 3D de l’intégralité du génome de la levure S. cerevisiae a été sondée par une méthode dérivée du 4C par Duan et ses collaborateurs en 2010. Les cartes générées ont montré un enrichissement de contacts entre les centromères, entre les télomères et suggèrent le regroupement des gènes codant les ARN de transfert transcrits par la Pol III (Duan et al., 2010).

Elles récapitulent donc les différentes caractéristiques attendues pour le génome de levure. De plus la fréquence accrue des contacts intra-chromosomiques par rapport aux contacts inter-chromosomiques a confirmé l’existence de territoires inter-chromosomiques chez la levure (Lorenz et al., 2002). En revanche, l’inspection des contacts intra-chromosomiques le long de la diagonale n’a pas révélé la présence de domaines d’association comparables aux TADs visualisables sur les cartes des cellules de mammifères. Cette première étude a donc conclu que les chromosomes de S.

cerevisiae n’adoptaient pas de conformation spécifique dans le noyau des cellules.

Quelques années plus tard, le laboratoire de Skotheim a ré-analysé les données générées par Duan et al. en calculant pour chaque séquence d’ADN son « score de couverture » définit comme le nombre d’interactions intra-chromosomiques contenant cette séquence. Une séquence à la frontière d’un TAD devrait avoir un score de couverture faible (cette séquence établie peu de contacts avec le reste du génome) alors qu’une séquence à l’intérieur d’un TADs devrait avoir un score de couverture plus important. Cette analyse a dévoilé la présence de domaines d’interactions le long des bras des chromosomes, que les auteurs comparent aux TADs présents chez les mammifères (Eser et al., 2017). Ces TADs mesurent environ 200 kb et sont donc du même ordre de grandeur que ceux analysés chez la drosophile (Sexton et al., 2012). Les séquences insulatrices correspondent à des régions chromatiniennes ouvertes, enrichies en Pol II et en marques d’histones spécifiques de la chromatine active telle que H3K4me3. Elles ne sont cependant pas significativement corrélées avec les pics d’accumulation des cohésines. Les auteurs ont ensuite

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recherché quelle pourrait être la fonction des TADs chez la levure. Aucun lien avec l’état transcriptionnel des gènes n’a été décelé ; cependant les gènes regroupés dans un même TAD semblent être répliqués dans la même fenêtre temporelle (Eser et al., 2017). Les auteurs ont donc conclu à l’existence de TADs de 200 kb chez la levure, en lien avec la réplication.

L’analyse de l’organisation du génome de levure par Micro-C a également dévoilé la présence de domaines d’associations chez S. cerevisiae (Hsieh et al., 2015). Comme mentionné plus haut, la technique de Micro-C consiste à fragmenter le génome par la nucléase micrococcale, clivant l’ADN non protégé. Les cartes de contacts ainsi obtenues ont une résolution de l’ordre du nucléosome, soit de 150 pb environ. Les domaines d’associations mis en évidence dans cette étude ont une taille variant entre 2 et 10 kb et comprennent entre 2 et 5 gènes. Les séquences insulatrices correspondent à des séquences ouvertes telles que des séquences promotrices enrichies en marques d’histones H3K18ac. Les auteurs identifient également que les cohésines sont accumulées à ces séquences (Hsieh et al., 2015).

Enfin, les laboratoires de Koszul et Baxter ont utilisé la technique de Hi-C afin d’étudier l’organisation du génome de levure au cours du cycle cellulaire (Lazar-Stefanita et al., 2017).

Aucune de ces deux études n’a rapporté la présence de TADs ou de domaines d’interactions dans cet organisme. Cependant, elles ont pu mettre en évidence une réorganisation des chromosomes entre la phase G1 et la mitose. Les contacts intra-chromosomiques et les contacts centromère-centromère semblent plus fréquents en mitose qu’en phase G1. Au contraire les contacts inter-chromosomiques semblent accrus en début de cycle. Ainsi les interactions entre les chromosomes sont réduites en mitose, suggérant leur individualisation à cette étape du cycle. De plus, la réorganisation des bras chromosomiques semble dépendre des cohésines. En effet, en absence de la sous-unité Scc1 les cartes de contacts ne traduisent pas d’individualisation des chromosomes en mitose mais suggèrent qu’ils conservent une organisation proche de celle observée en G1 (le ratio contacts intra-chromosomiques/contacts inter-chromosomiques n’est pas augmenté en mitose). Par ailleurs, les condensines ne semblent que très peu impliquées dans la compaction des chromosomes mitotiques de la levure S. cerevisiae contrairement à ceux des cellules de mammifères (voir plus haut). La déplétion de la sous-unité Smc2 des condensines ne conduit pas à la désorganisation des chromosomes mitotiques. En fait, les condensines semblent avoir un rôle lors de l’anaphase pour renforcer le regroupement des centromères et pour permettre le rapprochement de l’ADNr du

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centromère du chromosome XII (Lazar-Stefanita et al., 2017). Même si on peut penser que ce rapprochement spatial permette de faciliter la ségrégation de l’ADNr, sa fonction n’est pas connue.

En conclusion, chez la levure S. cerevisiae la compaction des chromosomes mitotiques est assurée principalement par les cohésines. Les condensines semblent avoir un rôle limité aux centromères et à l’ADNr. De plus la présence de TAD/domaines d’associations est toujours controversée dans cet organisme et lorsqu’ils sont décrits leur taille est différente de celle des TADs observés chez les mammifères.

ii. Chez S. pombe

Comme nous avons pu l’évoquer en préambule, S. cerevisiae et S. pombe sont deux espèces de levures relativement divergentes. Il faut noter quelques différences, pertinentes pour notre étude, entre ces deux organismes. Tout d’abord, les cohésines sont recrutées sur les chromosomes dès le début de la phase G1 chez S. pombe (Bernard et al., 2008). De plus il a été décrit dans cet organisme, la présence d’hétérochromatine comparable à celle observée chez les mammifères. Ceci est notamment expliqué par la présence d’un homologue à la protéine HP1 de D. melanogaster et de la marque histone H3K9me3 (Cam et al., 2005). Enfin, concernant le cycle cellulaire, la phase G2 peut être dissociée de la mitose chez S. pombe et elle représente en temps plus de la moitié du cycle (Tanizawa et al., 2017).

L’organisation des chromosomes de S. pombe, comme celle de S. cerevisiae, s’articule autour des centromères regroupés à la périphérie du noyau par le SPB, des télomères ancrés à l’enveloppe nucléaire et le nucléole situé à l’opposé du SPB. Cependant, l’analyse des repliements intra-chromosomiques chez S. pombe a révélé la présence de domaines d’interactions, appelés globules dans une première étude, le long de la diagonale des cartes de contacts de Hi-C (Mizuguchi et al., 2014; Tanizawa et al., 2017). Ces globules ont une taille d’environ 50 kb et leur formation dépend des cohésines. Ils sont détectables tout au long de l’interphase, même en phase G1. L’étude de l’organisation des chromosomes de S. pombe au cours du cycle cellulaire a révélé un deuxième type de repliement des chromosomes lors de la mitose (Kakui et al., 2017; Tanizawa et al., 2017) : des domaines de taille supérieure, de l’ordre du mégabase, dépendants des condensines. Ces deux types de domaines d’interactions semblent mutuellement exclusifs, i.e. ceux dépendants des cohésines ne sont présents qu’en phases G1, S et début de mitose alors que ceux dépendants des

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condensines ne sont détectables qu’en fin de G2 et mitose (Tanizawa et al., 2017). De plus, la déplétion des condensines n’affecte pas la formation des globules dépendants des cohésines et vice versa (Tanizawa et al., 2017). L’hétérochromatine semble également impacter l’organisation des chromosomes chez S. pombe (Mizuguchi et al., 2014). En effet, l’invalidation de la méthyltransférase établissant la marque répressive d’histones H3K9me3 conduit à la perte du regroupement des séquences centromériques et télomèriques qui interagissent alors plus fréquemment avec les bras des chromosomes.

Ainsi l’organisation du génome de S. pombe semble partager plus de caractéristiques avec celle des cellules de mammifères que celle de S. cerevisiae (présence de domaines d’association en G1, compaction des chromosomes par les condensines en mitose). Cependant un dérivé de la technique de Micro-C a révélé la présence chez S. pombe de domaines d’associations comprenant de 1 à 5 gènes, comparables à ceux détectés par la même technique chez S. cerevisiae (Hsieh et al., 2016). De plus, la protéine CTCF n’est pas encodée par le génome de S. pombe (Acemel et al., 2017). Le mécanisme de formation des globules dépendant des cohésines doit donc être sensiblement différent dans les cellules de mammifères et dans cet organisme. En effet, d’après une étude in silico, en absence de barrières établies par CTCF, la seule action des cohésines ne suffit pas à établir des domaines d’association topologiques le long des bras des chromosomes (Benedetti et al., 2017). Cette étude propose que la formation des super-enroulements induits par la transcription des gènes soit à l’origine de la formation des globules (Benedetti et al., 2017).

c. L’ADN ribosomique

A ce point du manuscrit, nous avons abordé les repliements de la fibre de chromatine à différentes phases du cycle cellulaire et dans divers organismes modèles. La majorité des données présentées ont été obtenues par les C-techniques et par conséquent, par des approches basées sur le séquençage massif de l’ADN. Néanmoins, comme nous l’avons précisé lors de la description de ces techniques, elles ne permettent pas de sonder l’organisation des séquences répétées qui peuvent représenter jusqu’à deux tiers du génome humain (de Koning et al., 2011). Les C-techniques ne

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