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i. Conditions expérimentales et solutions

Canaux calciques

Le BAPTA (pour 1,2-Bis(o-aminophenoxy)éthane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid, en anglais) est un agent de chélation fortement sélectif pour les ions Ca2+, composé de 100 mM d’acide BAPTA-free (Sigma), 10 mM de CsOH, et 10 mM d’HEPES (pH = 7.2). Celui-ci est utilisé pour contrôler les niveaux de Ca2+ intracellulaire, et dans notre étude, afin d’inhiber les autres courants activés par le Ca2+ lors de l’enregistrement des courants calciques. Le BAPTA est injecté en cours d’enregistrement au moyen d’une troisième microélectrode, façonnée de manière

139 identique aux autres électrodes, et connectée à un microinjecteur similaire à celui des ARN (20 nl injectés, -soit une concentration d’environ 5 mM finale au sein de l’ovocyte-, pression et temps d’injection identiques). Pour les canaux calciques, la solution d’enregistrement correspond au Bant10 (Tableau 10).

Canaux sodiques

Pour ces canaux, les conditions expérimentales sont identiques à celles mises en place pour l’enregistrement des courants calciques. En revanche ici, l’utilisation de BAPTA est inappropriée et la solution d’enregistrement correspond à du ND-Herg (Tableau 10).

ii. Protocoles

Ca-test

Les courants macroscopiques sont enregistrés sous voltage-clamp à deux électrodes en utilisant un amplificateur GeneClamp 500 (Axon Instruments, Union City, CA). Les électrodes de courant et voltage sont remplies d’une solution de KCl 3M. Les courants Ca2+ sont enregistrés durant des tests d’impulsions de 100 msec (CaV3) ou 400 msec (autres canaux), par incréments de +10 mV, allant d’un potentiel de -110 mV à +30 mV (CaV3) ou de -80 mV à +70 mV (autres canaux), séparés par des intervalles de 10 secondes, durant lesquels les ovocytes sont maintenus à un potentiel de -80 mV. L'amplitude du courant est mesurée au pic du courant. Les courants enregistrés sont filtrés (500 Hz) et numérisés (2 kHz) en utilisant une interface Digidata-1200 (Axon Instruments). Ceux-ci sont stockés sur ordinateur personnel grâce au logiciel pClamp version 7.1, et leur analyse est permise grâce à la version 10. La courbe I-V enregistrée pour chaque ovocyte a été normalisée par rapport à son pic maximal. Enfin, les relations courant-voltage normalisées ont été faites selon une distribution de Boltzmann rectifiée en utilisant l’équation suivante :

I/Imax = g*(V - Erev) / (1 + exp((V - Vact)/ka)),

où I est l’amplitude de courant mesurée durant les étapes de voltage variant de -80 à +60 mV, Imax est l’amplitude du pic de courant mesurée au minimum de la courbe courant-voltage, g représente la conductance normalisée, V la valeur de voltage, Erev le potentiel d’inversion de courant, Vact est le potentiel de demi-activation, et ka représente le facteur de pente.

140 Ces tests ont été réalisés sur n ovocytes et la moyenne de ces courbes I-V normalisées point à point a été réalisée.

Ca-inac

Le potentiel de repos choisi est de -100 mV, potentiel auquel tous les canaux sont à l’état de repos. Les courants de Ca2+ sont déclenchés selon un protocole de double pulse, par des successions d’étapes de dépolarisation d’une durée de 2,5 secondes, allant d’un potentiel de membrane de -80 mV à +30 mV avec des incréments de +10 mV. La dépolarisation test est à une valeur de -30 mV (CaV3) ou +10 mV (autres canaux) et une durée de 100 msec (CaV3) ou 400 msec (autres canaux). Les courants enregistrés sont alors filtrés et numérisés, puis stockés sur ordinateur personnel grâce au logiciel pClamp version 7.1. Le logiciel pClamp version 10 permet alors l’analyse de ces courants, en mesurant le pic de courant, le temps au pic, ainsi que la constante de temps d’inactivation de ces courants enregistrés en fonction du voltage (Figure 32). Enfin, l’équation permettant d’ajuster la courbe d’inactivation est :

I/Imax = R + (1 – R) / (1 + exp((V - Vinac)/ki)),

où I est l’amplitude de courant mesurée durant un test pulse à +10 mV pour les étapes de voltage variant de -80 à +60 mV, Imax est l’amplitude de courant enregistré après un pré-pulse conditionnant à -80 mV, V représente le voltage, R la proportion de courant non-activée, Vinac

est le potentiel de demi-inactivation, et ki le facteur de pente.

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Figure 32 : Illustrations de la relation courant-voltage pour les canaux CaV et NaV, et des courbes d’activation et inactivation. (A) Relation courant-voltage (I-V) pour les canaux CaV et NaV. Des impulsions dépolarisantes (400 msec) à -80 mV sont suivies d'impulsions test, allant de -100 mV jusqu’à +30 mV par incréments de +10 mV. Les pics de courants sont normalisés en fonction du courant de pic d'une impulsion test, et tracés en fonction du potentiel. (B) Courbe d’inactivation du courant de canal Ca2+ dépendant du voltage. Celle-ci permet de déterminer le potentiel de demi-inactivation (Vinac), la pente (kinac), ainsi que la fraction de canaux non-activée (R). (C) Courbe d’activation du courant calcique de canal Ca2+

dépendant du voltage. Celle-ci permet de déterminer le potentiel de demi-activation (Vact) et le facteur de pente (kact).

Les divers venins et toxines ayant pu être testés durant ce projet ont été dilués avec de l’eau distillée (en fonction de leurs concentrations mesurés), et stockés à -80 degrés au sein de l’institut. Enfin, les concentrations finales souhaitées ont été faites dans du Bant10 (Tableau 10) juste avant l’expérience. Afin d’analyser l’effet des venins, les ovocytes exprimant les canaux calciques sont tout d’abord enregistrés à l’aide du protocole Ca-test, en étant perfusés par du Bant10 (Figure 33). La perfusion est alors arrêtée, et on vérifie alors que les courants ne subissent aucun « run-down ». Après une à deux minutes (environ 4-8 stimulations), 30 µL (correspondant au volume de la partie de la cuve contenant l’ovocyte) de solution Bant10 contenant les toxines ou venin à la concentration voulues sont ajoutés au bain à l’aide d’une micropipette. 15-30 stimulations sont ensuite enregistrées, en perfusion toujours arrêtée.

142 Eventuellement la perfusion de Bant10 peut être remise en route pour assister à la réversibilité d’un effet. Les effets sont analysés à l’aide d’un graphique montrant l’amplitude du pic du courant (et éventuellement ses cinétiques d’inactivation) en fonction du temps, avant, pendant et après l’ajout de toxine ou venin. L’effet est quantifié en pourcentage d’inhibition/d’augmentation du courant Ca2+ enregistré à l’équilibre.

Figure 33 : Schéma de la chambre d’enregistrement de l’ovocyte, sur un poste d’électrophysiologie classique. En bleu est montré l’entièreté de la chambre d’enregistrement (200 µl), et en rouge, la chambre où est disposé l’ovocyte à enregistrer.

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