BUT et STRATEGIE

Le but général de notre travail a été d'étudier dans une perspective physiologique l'interaction d'un signal hormonal et de son tissu cible.

Nous avons d'abord choisi comme objet d'étude l'adénylate cyclase thyroïdienne. En effet, J_°) l'activation de l'adénylate cyclase par un signal extracellulaire est l'un des principaux mécanismes bio­ chimiques de modulation cellulaire, ce qui conférait à notre sujet un caractère très général.

^°) la thyroïde est relativement homogène ce qui permettait d'espérer des résultats clairement interprétables.

^“) des travaux antérieurs du laboratoire avaient montré que la plupart des effets de la TSH sur la thyroïde sont causés par le cAMP.

^°) les travaux poursuivis par d'autres au laboratoire permettaient d'espérer que l'on pourrait mettre en relation les données obtenues en système acellulaire et les données obtenues sur cellules intactes.

29.

Les travaux menés sur l'adénylate cyclase thyroïdienne sont complémentaires à l'étude des récepteurs hormonaux eux-même. Pour des raisons diverses (complexité de la TSH, manque d'analogues, ignorance de la structure, etc..) les résultats obtenus sur les récepteurs de la TSH risquaient d'être ambigus.

La nécessité méthodologique de posséder un ligand de choix (qui n'existe pas encore pour les récepteurs à la TSH) nous a poussé à choisir un modèle expérimental plus simple pour cette partie du travail : le récepteur adrénergique. L'état des connaissances de la pharmacologie des récepteurs ^adrénergiques et plus particu­ lièrement l'existence d'agonistes, d'isomères optiques et d'anta­ gonistes à haute affinité pouvant être radiomarqués ont orienté

notre choix vers ce système pour la caractérisation d'un récepteur par l'étude de la liaison de ligands. Notre but a été de mettre au point ue

méthodologie permettant de caractériser et de quantifier les récep­ teurs Jh adrénergiques sur cellules intactes. L'étude sur cellules intactes a l'avantage d'être physiologique et offre un outil de qua­ lité qui devrait permettre de compléter et d'étendre l'étude des récepteurs faite essentiellement sur des préparations membranaires. Nous avons abordé cette étude sur des cellules C 6 de gliome de rat en culture. Cette lignée est aisée à obtenir, à cultiver et

à manipuler. De plus des études pharmacologiques avaient montré la présence sur ces cellules de récepteurs /^-adrénergiques (Gilman et Nirenberg, 1971) présentant la propriété très générale de désensibi­ lisation ou réfràctorité (de Vellis et Brooker, 1974). C'est sur cette lignée cellulaire que nous avons mis au point la méthodologie de la mesu­ re de la liaison de ligands et la caractérisation des récepteurs padréner giques sur cellules intactes. Nous avons ensuite applique cette

méthodologie aux cellules de muscle squelettique en culture. Un tra­ vail récent (Atlas, Hanski et Levitzki, 1977) suggérait que ces cel­

lules auraient une densité extrêmement élevée de récepteurs ^ et pour­ raient être un système de choix pour aborder la purification et

l'iso-30.

lement du récepteur. Notre étude a infirmé cette hypothèse

(cf chapitre V). Le succès de la méthodologie utilisée a suscité des collaborations avec d'autres groupes de recherche de notre Université (R. Kram, département de Biologie Moléculaire et G. Delespesse, département d'immunologie. Hôpital St Pierre). Nous avons pu, en collaboration avec le premier groupe, carac­

tériser les récepteurs ^ des cellules érythroleucémiques de Friend. Cette étude ne sera pas développée dans le présent travail.

L'intérêt d'une extension en immunologie de nos travaux nous a conduit à étudier les récepteurs /4 sur les lymphocytes amygda-liens humains et sur leurs, sous populations cellulaires.

Des études biochimiques et pharmacologiques ont démontré (cf Intro­ duction) l'existence de récepteurs yS adrénergiques sur les lympho­ cytes ainsi que le rôle que ceux-ci jouent dans la modulation de la réponse immune •

Le système des leucocytes constitue , spécialement chez l'humain, un modèle facilement manipulable pour l'étude d'une pathologie

(l'asthme) dans laquelle serait impliquée une altération au niveau des récepteursy^ adrénergiques (Szentivanyi, 1968). En effet, chez l'homme le lymphocyte et le parench3nne pulmonaire possèdent

le même type

2

^ récepteuradrénergique (Conolly et

Greenacre, 1977). De plus la réponse physiologique et pharmacologique des muscles lisses bronchiques aux catécholamines joue un rôle clé dans l'asthme (Conolly et Greenacre, 1976). Il était donc raison­ nable de considérer le lymphocyte humain comme un bon modèle pour étudier une éventuelle altération chez les asthmatiques de leurs récepteurs adrénergiques.

CHAPITRE II

Pages

M

éthodes générales

... ...

3i 1. PRELEVEMENT DES GLANDES ... 31 2. HOMOGENEISATION ... 31 3. INCUBATION DES TRANCHES ... 32 4. PREPARATIONS MEMBRANAIRES A PARTIR DES HOMOGENATS

DE thyroïde ... 32 5. MESURE DE L'ACTIVITE DE L'ADENYLATE CYCLASE ... 33 6. SYNTHESE DE L'^^^I lODOHYDROXYBENZYLPINDOLOL,

^^^I-(+^)-HYP ... 33 7. MESURES DE LA LIAISON DE ^^^I-HYP SUR CELLULES

INTACTES ... 34 8. DOSAGE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES CHOISIES COMME

MARQUEURS ... 38 9. DOSAGE DES PROTEINES ... 38 10. MILIEUX ... 38bis

1. PRELEVEMENT DES GLANDES

Les glandes thyroïdes ont été prélevées sur l'animal (généralement le cheval) dans les cinq minutes qui suivent l'abattage et transportées au laboratoire, à 0°C, dans du NaCl 9 %o. Les glandes ont été disséquées avec soin des parathyroïdes éventuelles, de leur capsule et des tissus conjonctif et adipeux avoisinants.

2. HOMOGENEISATION

Deux techniques ont été employées selon qu'il s'agissait de tranches de tissu après incubation ou de tissu frais utilisé à des fins préparatives. Dans le premier cas, les tranches de thyroïde étaient finement hachées au moyen d'un hachoir automatique (Mc Ilwain- Tissue Chopper). Dans le second, les glandes sont d'abord émincées au moyen de ciseaux avant d'être hachées manuellement au moyen d'un

hachoir ménager multilame ("hache-vite"). Dans les deux cas, la bouillie tissulaire obtenue est homogénéisée dans un homogéneisateur teflon-

verre dont le piston est animé d'un mouvement rotatif. De 5 à 10 passes sont habituellement réalisées. Cette méthode d'homogénéisation particulièrement peu agressive est la seule qui nous ait donné de bons résultats. Toutes ces opérations se déroulèrent toujours entre 0 et 4°C. Le milieu d'homogénéisation est constitué par 0.25M sucrose, 25 mM

Tris-32.

3. INCUBATION DES TRANCHES

Les glandes nettoyées ont été coupées en tranches d'environ 0,5 mm d'épaisseur au moyen du microtome de Stadie-Riggs. Les tran­ ches ont été incubées à 37°C sous carbogène (95 % O2, 5 % CO2) dans du tampon Krebs Ringer bicarbonate enrichi avec 8 mM glucose et 0,5 g/L d'albumine bovine sérique. La proportion entre le poids humide des tranches et le milieu d'incubation a été de 100 mg par 40 ml de milieu.

4. PREPARATIONS MEMBRANAIRES A PARTIR DES HOMOGENATS DE THYROÏDE

Un milieu aqueux à deux phases a été préparé préalablement de la manière suivante : à 190 ml de Dextran T 500 (22 % w/v) sont mélangés 100 ml de polyéthylène glycol 6000 (30 % w/v), 200 ml Tris- HCl 0.2 M pH 7.4 et 100 ml d'eau bidistillée. Le mélange est intime­ ment mélangé, décanté dans une ampoule pendant 48 heures et les 2 phases

séparées. La phase supérieure est enrichie en polyéthylène glycol alors que la phase inférieure l'est en dextran.

L'homogénat de thyroïde filtré sur deux couches de gaze est centrifugé à 800 g pendant 5 minutes (Sorvall rotor HB4, 2200 rpm) Le culot est lavé deux fois avec le milieu d'homogénéisation et resus­ pendu dans la phase supérieure du milieu à deux phases. Un volume égal

(^ 15 ml) de la phase inférieure est ajouté et le tout intimement mélang Le mélange est centrifugé pendant 15 minutes à 12.000g

(Sorvall rotor HB4,860Grpm)et la fraction enrichie en membranes plasma­ tiques est recueillie à l'interphase, resuspendue dans le milieu d'homo­ généisation et centrifugée à 10.000 g pendant 10 min. L'ensemble des opérations a été réalisé à 4°C. Cette préparation a pu être stockée pendant 15 jours dans l'azote liquide sans modification sensible de l'activité adénylate cyclase.

33.

5. MESURE DE L'ACTIVITE ADENYLATE CYCLASE.

32 L'activité enzymatique est mesurée par la conversion de ATP-0(-P en cAMP^^. Le milieu réactionnel (200 ul)tamponné à pH 7.4 contient de

' 32

l'ATP 3 mM, du MgCl2 5 mM, du cAMP 2 mM, du Tris-HCl 50 mM, de l'ATP-ov-P 2^Ci, 0.1 % albumine bovine sérique,de la créatine phosphate lOmM et 60 de créatine kinase de muscle de lapin.Les membranes 200^g de protéines)ou l'homogénat (+^ 1 mg protéines) sont incubés dans le milieu réactionnel pendant 20 min. à 30°C. Lorsque la mesure de l'activité enzymatique a été effectuée sur de l'homogénat de l'IBMX 1 mM a été ajouté au milieu réactionnel pour inhiber l'activité phosphodiestérase. A la fin de la réaction 100 ^1 d'une solution contenant de l'ATP 50 mM, du cAMP 20 mM et du cAMP H 20.000cpm sont ajoutés au milieu réactionnel qui est cen­ trifugé à 5.000rpm pendant 15 minutes et le surnageant est ensuite passé sur colonne d'oxyde d'aluminium neutre. L'oxyde d'aluminium neutre (+^ 2 g) a été préalablement activé à 100°C pendant 3 heures et conditionné à sec dans des colonnes de verre. Le surnageant (+^ 300 ^1)

déposé au sommet de la colonne estélué par 6 ml de tampon tris HCl 50 mM pH 7.4. Les 3 premiers ml de l'éluat sont écartés et les 3 suivants collectés dans des fioles à scintillation auquel 15 ml de

. . ^ 3 liquide de Bray sont ajoutés avant comptage de la radioactivité ( H et 32

P) dans un compteur à scintillation liquide Packard.

6. SYNTHESE DE L'’^^IODOHYDROXYBENZYLPINDOLOL, ^^^I-(+)-HYP

L'iodure est oxydé par la Chloramine T et peut sous cette forme attaquer le noyau phénol du groupement hydroxybenzyl de la molécule de HYP. La réaction est arrêtée grâce à un réducteur^ le métabisulfite.

La réaction est effectuée dans un volume final de 45 ul pendant —9

3 min et à 21°C de la manière suivante . 5 ^1 de HYP (5.10 gf (10 mM) dissout dans l'acétate d'éthyle sont déposés et évaporés sous azote dans le tube réactionnel en polypropylëne (Falcon). On y ajoute 30 ul

de tampon phosphate pH 7.4 et 10 ul d' I (1 mCI) (Amersham 1850 Ci/mmole)

—9 — ^

34.

.-9

ramine T 0,75 mM (3,8 10 gr). Apres 3 min. 500 jil de métabisulfite de soditim (1 mg/ml dans l'acide acétique 1 M) sont ajoutés. Les pro­ duits hydrophobes à savoir le HYP en excès, les HYP mono et diiodés sont ensuite extraits 4 fois par 500 ;ul d'acétate d'Ethyle contenant 10 M de phénol fraîchement distillé. Le volume d'extraction est réduit 10 à 20 fois par évaporation sous azote et ensuite déposé sur papier Whatmann 3 MM et soumis à une chromatographie dépendante .

pendant 12 heures, par du formiate d'ammonium O.IM pH 8.5 et du-phénol O.lmM.

Ovv . C

1 O C , V 125

L' ^I-HYP monoiodé (Rf = 0.07 >est ainsi séparé de l'iodure I (Rf=l' du HYP (Rf=0.6) et du HYP diiodé (5% de la radioactivité totale) (Rf=0).

,125,

L'“■ I-HYP monoiodé est élué du chromatogramme par le mélange acé­ tate d'éthyle, diethylamine (98/2) et stocké à - 80°C en présence de 0.1 mM phénol à une concentration de lOO.OOOcpm par yl. Le rendement de la réaction est d'environ 30 %. L'ensemble des opérations est

ef-125

fectué à l'abri de la lumière. L'activité spécifique de 1' I-HYP est -15

celle de l'iode 125 utilisé (+ 2000 cpm/10 mole).

7. MESURES DE LA LIAISON DE '^^I-HYP SUR CELLULES INTACTES.

a. Sur cellules en_culture adhérentes aux boites de Pétri.

Les souches utilisées ont été les cellules C6 de gliome de rat et les cellules L8 de myoblaste de rat. Ces cellules ont été cultivées par H. Schmitt (actuellement Département de Biologie Molé­

culaire, U.L.B.) et fournies par D. Yaffe et l'Institut Weizmann (Israël). Les C6 sont cultivées sur des boites Falcon dans du milieu DMEM

(Gibco) additionné de sérum de veau foetal ( Gibco) sous une atmos­ phère contenant 95 % d'air et 5 % CO^. Les cellules en phase expo­ nentielle de croissance sont détachées par trypsinisation et distri­ buées en boite de Pétri de 3.5 cm de diamètre. La mesure de la liai­ son est effectuée 48h au moins après cette sous culture.

35.

Chaque boite contenant environ 2.10 cëllules est lavée avec 5 ml de PBS (Phosphate Buffered Saline) et incubée 30 min. à 37°C avec 0.8 ml de

125 -5

PBS contenant différentes concentrations de I-HYP et 5.10 M de phentolamine. Après incubation le milieu est aspiré et les boites

lavées 5 fois avec 2 ml de PBS à température ambiante, suivie par 6 lavages de 10 minutes chacun. Les cellules sont ensuite détachées des boites par 1 ml de trypsine 0,1 % dans un milieu isotonique D-1 et comptées au compteur gamma. La culture et la mesure de la liaison des cellules L8 de muscle sont identiques à celles des C6.

^• Sur lymphocytes amygdaliens humains. 1. Préparation des lymphocytes amygdaliens.

Ces préparations ont été effectuées par H. Collet ( dépar­ tement d’immunologie de l'Hôpital St Pierre).

1.1. Lymphocytes totaux

Les amygdales palatines de. patients généralement jeunes (8 à 16 ans) ont été prélevées stérilement et transportées dans du milieu RPMI 1640 à 0°C (Flow Laboratories, Rockville, Md) contenant de la pénicilline 1000 Unités/ml, de la strçtomycine 500 yug/ml,de l'amphoté- ricine B 1 ;ug/ml (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) et

1 pg/ml de gentamycine. Le tissu a été coupé et pressé pour en extraire le "jus" lymphocytaire. Les fragments de tissu et de cellules sont

alors éliminés et la siispension de cellules est lavée 3 fois avec du Hank' (milieu isotonique et tamponé HBSS) sans calcium et magnésium

(Grand Island Biologicals) puis resuspendues à la densité désirée (^ 50 10^ cellules/ml) dans du Hank's contenant du Mg"*^^ 10 mM et du tris HCl pH 7.4 50 mM. Les lymphocytes totaux amygdaliens sont constitués dans ces conditions de préparation par environ 42 % de lymphocytes T, 43 % de lymphocytes B et 15 % de cellules non identifiées (Delespesse et coll., 1976).

36.

1.2. Préparation des rosettes (E-RFC) de_globules rouges de^mou|gng

1SRBCi.

0.2 ml de SRBC 2 % dans du HESS ont été mélangés à 0.2 ml de lymphocytes amygdaliens (4.10 cellules/ml et incubés à 37°C pen­ dant 15 min. (méthode de Jondal et coll., 1972). Le mélange a ensuite été centrifugé à 100 g pendant 3 min. à température ambiante et incubé à 0°C pendant 16 heures. Le culot est ensuite resuspendu délicatement par agitation mécanique et le pourcentage de lymphocytes ayant liés plus de trois érythrocytes est alors déterminé.

i

i ■

1.3. Purification des lymphocytes T et B. 1.3.1. Par la technique des rosettes :

1°) Lymphocytes B

-o-o-o-o-o-o-Les lymphocytes B sont obtenus en séparant les cellules ayant formé des rosettes des autres lymphocytes. Le culot de lymphocytes préparé en 1.2 est délicatement resuspendu et centri­ fugé (30 min., 450 g à 20°C) sur un coussin de Ficoll-Hypaque (d=l,077) . Les cellules à l'interphase (enrichies en B) sont récupérées et lavées deux fois dans du milieu Hank's. Le culot est conservé pour préparer les lymphocytes T. Dans ces conditions sur 100 cellules de l'interphase moins de 5 sont des lymphocytes T et environ 30 sont des cellules non identifiées, c'est-à-dire n'ayant ni IgG ni IgM ni IgA détectable sur leur surface et 60 % ont des Ig détectables.

2°) Lymphocytes T

-o-o-o-o-o-o-Les rosettes (lymphocytes + globules rouges) sépa­ rées par centrifugation sur Ficoll sont lavées 2 fois dans du HESS. Les globules rouges de mouton sont lysés en incubant les rosettes dans du NH^Cl (0,83 % pH 7.3) 5 min à 37°C et les lymphocytes sont récupérés par centrifugation (300 g 5 min). Dans ces conditions, la préparation contient en moyenne 81 % de lymphocytes T, moins de 5 % de cellules B et 1,6 % de monocytes (Pochet et coll., 1979).

37.

1.3.2. Par filtration sur colonnes

—O—O—0“0“0“0—O—0“0“O—O—o~o~

Les lymphocytes T ont été purifiés par filtration sur colonne de nylon d'après la technique décrite par Greaves et Brown

(1974) et modifiée par Delespesse et coll. (1976).

Un gramme de laine de nylon (Leukopak, Fenwall Lab., Morton Grove, 111.) prétraité avec HCl 0.2 N et H2O est conditionné dans une colonne (13 x 200 mm). Avant utilisation^la colonne est

g

rincée avec du milieu de culture maintenu à 37°C. 2.10 lymphocytes dans 2 ml de milieu de culture sont appliqués sur la colonne. Celle- ci est incubée 30 min. à 37®C avant d'être éluée. Deux populations de lymphocytes T peuvent être élués. Lorsque la vitesse d'élution est maintenue à 7-14 gouttes par minute, une première fraction Fj est ob­

tenue. Celle-ci contient 71 % de cellules pouvant former des rosettes (lymphocytes T) 3 % de lymphocytes B et 26 % de cellules non identi­ fiées. Une deuxième population de lymphocytes T (fraction F2) peut être éluée de la colonne en augmentant sensiblement la vitesse d'êlu- tion. Cette fraction F2 contient 82 % de lymphocytes T (mesurée par la technique de rosettes) 15 % de lymphocytes B et 4 % de cellules non identifiées.

125

2. Mesure de la liaison de 1' I-HYP aux lymphocytes amygdaliens humains. La qualité de la mesure réalisée dépend de l'utilisation d'une rampe de filtration YEDA (Linca Products-Israel) à dix places à aspira­ tion égale et reproductible ainsi que de l'utilisation de tubes en poly-propylène (12 x 75 mm Falcon). Ces tubes ont un faible pouvoir adsorbant

125

pour 1' I-HYP par comparaison avec des tubes en verre ou en polystyrène. En routine les lymphocytes (5.10^/ml) sont incubés en présence de

dif-125

férentes concentrations de I-HYP dans un volume de 500 jul contenant du milieu Hank's,du tris HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM et de la phentola- mine 5.10 ^M. Le Mg^^ a été ajouté car il aidait à prévenir' l'aggré- gation des cellules pendant 1'.incubation.. . La réaction est initiée

38.

à SO^C le mélange est dilué avec 5 ml de Tris HCl pH 7.4 50 mM, 10 mM MgCl^ à 37°C et immédiatement filtré sur filtre en fibre de verre

(Whatmann GF/C) de 25 mm de diamètre . La filtration est assurée par dépression. Les filtres sont lavés par 20 ml du même tampon à 37°C, sé­ chés et comptés dans un compteur gamma Packard (efficience 60 %) .

8. DOSAGE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES CHOISIES COMME MARQUEURS. a. Phosphatase acide (EC 3132)

L'activité est mesurée par l'hydrolyse du p-nitrophenyl phosphate à pH 4.8. Le p-nitrophenylphosphate (5.5 mM) est incubé 20 min. à 37°C en présence des différentes fractions subcellulaires. La réaction est arrêtée par l'ajoute de 2 ml de NaOH 0.5 N et l'absorbance est mesurée à 405 nm (Smidt, 1955).

^ • Na~*~ - K~^ATPase (EC 3613)

La méthode utilisée est celle de Takagi (1968) : mesure du phos­ phate libéré au cours de l'hydrolyse de l'ATP.

c. Dosage de la ferrocytochrome C;0^ oxydoréductase (EC 1.9.3.1.)

L'activité est mesurée en suivant la décroissance de l'absorbance à 550 nm du cytochrome C réduit, à température ambiante (Chantrenne 1955)

9. DOSAGE DES PROTEINES.

Les protéines sont dosées selon la méthode de Lowry et coll. (1951) avec de l'albximine sérique de boeuf comme standard.

10. MILIEUX.

Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2*2H20 1 piM KCl 2.7 mM K H2 PO^ 1,25 mM MgCl2 0,5 mM NaCl 137 mM NaH„P0, 2 4 ^{6,45 mM}

2. Krebs Ringer Bicarbonate (KRB). CaCl2«2H20 _{1,45 mM} KCl 5 mM KH2PO4 1,25 mM MgCl2 1,25 mM NaCl _{124 mM} NaHCO 25,3 mM “2 ^{5 %}

3. Hank's Balanced Sait Solution (HESS). NaCl KCl MgSO^ + H2O Na^HPO^ (anhydre) KH^PO^ Glucose 8000 mg/litre 400 mg/litre 100 mg/litre 48 mg/litre 60 mg/litre 1000 mg/litre 10 mg/litre Phénol red

CHAPITRE III

U TSH ACTIVE

l

'

adénylate cyclase en système

ACELLULAIRE

Pages INTRODUCTION ... 39 RESULTATS

A. Méthodologie du dosage de l'activité adénylate cyclase

thyroïdienne :... 42 B. Fractionnement sufacellulaire ... 50 C. Caractérisation du système adénylate cyclase sensible

à la TSH ... 54 1. La réaction d'activation de l'adénylate cyclase thy­

roïdienne par la TSH est rapidement réversible ... 55 2. La réaction est saturable et à haute affinité... 55 3. La cinétique d'association est rapide ... 57bis 4. L'hormone n'est pas dégradée pendant l'incubation .. 57bis 5. L'activation de l'adénylate cyclase par la TSH pré­

sente des caractéristiques de coopérativité positive

et négative ... 60 5.1. La théorie de l'occupation de Clark... .'.... 60 5.2. Représentations graphiques ... 62 5.2.1. Représentation directe ... 63 5.2.2. Représentation de Scatchard ... 64 5.2.3. Représentation doublement réciproque ... 66 5.3. Analyse des expériences de saturation ... 69 5.4. Analyse de la courbe concentration=effet (TSH

versus activation adénylate cyclase) dans la

thyroïde... 69 5.4.1. Effet de l'ITP ... 70 6. Calcul du nombre des récepteurs couplés à la TSH .. 75 DISCUSSION ... 79

39.

I

ntroduction

Le modèle de Sutherland introduit précédemment (cf Introduc­ tion p. 7 ) a été validé dans le cas de la thyroïde. Cette étude

très extensive ®t présentée dans la thèse de J. Van Sande (1976). Elle a montré que les 4 critères proposés par Sutherland ont été véri­

fiés tant d'un point de vue qualitatif que quantitatif. En colla­ boration avec J. Van Sande et J.M. Boeynaems (Boeynaems et coll.,

1974; Pochet et coll., 1974), nous avons participé à cette étude et nous nous sommes attachés plus particulièrement à démontrer le premier critère.

La TSH active l'adénylate cyclase thyroïdienne. Cette modu­ lation enzymatique est la première étape biologique mesurable dans l'action hormonale. Elle constitue le premier maillon de la chaine de réactions dites cAMP dépendantes qui conduisent à une activation fonctionnelle plus lointaine de la glande à savoir la sécrétion d'hormones thyroïdiennes et . Cette étape constitue également un excellent paramètre permettant d'étudier de manière fonctionnelle l'interaction entre la TSH et son récepteur. La mesure directe de la liaison de l'hormone à son récepteur constitue une appro­ che parallèle et complémentaire. Cette mesure n'est interprétable et ne peut être validée que si nous disposons d'un arsenal de critères qui nous permettent de déterminer à coup sûr que la liaison mesurée est celle correspondant à une interaction avec le récepteur hormonal. Comme nous le verrons au chapitre V, nous avons abordé cette étude dans un système plus simple lors de la mesure de la liaison d'anta­ gonistes aux récepteurs ^5 -adrénergiques.

Pour valider le premier critère de Sutherland il a fallu démontrer 1°) que chronologiquement l'activation de l'adénylate cy­ clase était la première manifestation mesurable de l'action de la TSH

40.

et 2°) que les concentrations d'hormones utilisées pour mesurer une activation enzymatique étaient inférieures ou tout au plus égales à celles nécessaires pour mesurer une réponse cAMP dépendante plus lointaine.

Dans un premier temps nous nous sommes attachés à la mise au point d'une méthode de mesure de l'adénylate cyclase thyroïdienne

(Résultats A). La préparation d'une fraction subcellulaire enrichie en membranes sensible à la TSH est résumée dans la section Résultats B.

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