M ATÉRIEL

IX.1.1 Souches et milieux de culture

DJ624 : MG1655 lacX74 mal::lacI^q

DJ624 (λsfiA::lacZ)

DJ624Δara

MC1061 : F-araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 Δ(lac)X74 rpsL(STRr) hsdR2

(rK-mK+) mcrA mcrB1

Les cultures ont été faites sur différents milieux. Luria-Bertani (LB) solide et liquide [150] :

Liquide : 1% tryptone, 0,5% d’extrait de levure et 0,5% de NaCl.

Solide : 1% tryptone, 0,5% d’extrait de levure et 0,5% de NaCl et 3g d’agar par

250 ml de milieu.

Ceria 132 synthétique (CM) [151] supplémenté de 0,2% de casamino acides (CCM) : M9 1x, 0,2% casmino-acid et 3g d’agar par 250 ml de milieu, Cacl2 (0,1M), MgSO4 (1M), vitamine B1.

IX.1.2 Vecteurs

pBAD33 : le vecteur pBAD33 contient le promoteur pBAD (promoteur naturel de

l’opéron arabinose araBAD d’E. coli), le gène araC (codant pour le régulateur de ce

promoteur) et le gène codant pour la résistance au chloramphénicol. Le promoteur pBAD est régulé finement par la protéine AraC. En absence d’arabinose, AraC est un répresseur de la transcription, alors qu’en présence d’arabinose, cette protéine est un activateur de la transcription. Ce vecteur a été utilisé pour cloner les gènes des toxines putatives car en absence d’arabinose, la répression de ce promoteur est forte et minimise donc le risque d’expression du poison putatif. La répression du pBAD peut être améliorée en ajoutant du glucose au milieu de culture induisant ainsi la répression catabolique. Le vecteur pBAD33 contient un MCS. Comme il n’y a pas de RBS en amont du MCS de ce vecteur, il faut prévoir

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l’ajout d’un RBS dans la séquence du primer amont. Le RBS consensus utilisé est AGGAGG. Le pBAD33 contient le réplicon de p15A.

pKK223-3 : le vecteur pKK223-3 porte le gène codant pour la résistance à l’ampicilline et contient le promoteur pTac. Celui-ci est réprimé par la protéine LacI et est

inductible par l’addition d’isopropyl-β,D-thiogalactopyranoside (IPTG) qui inhibe le

répresseur LacI. En absence d’IPTG, la répression du promoteur par LacI n’est pas totale et il subsiste une expression à un taux basal. Dès lors, nous avons choisi ce vecteur pour cloner les antitoxines. Ce vecteur contient un MCS en amont duquel il y a un RBS. Le pKK223-3 contient le réplicon de ColEI.

pBAD-staby : le vecteur pBAD-staby contient le promoteur pBAD. Ce vecteur contient également une cassette de résistance à l’ampicilline. Il est commercialisé par Delphi Genetics avec des bactéries produisant la toxine CcdB. Le gène codant pour cette toxine se trouve dans le chromosome. Un fragment incomplet du gène de CcdA, l’antitoxine associée à CcdB, se trouve dans le MCS reverse du pBAD-staby. Lors de la PCR pour amplifier le

fragment à cloner, les quatorze dernières paires de base de ccdA sont ajoutées à l’aide des

primers. Si l’insert est cloné dans le pBAD-staby, l’antitoxine complète est exprimée et peut contrecarrer l’activité toxique de CcdB. À l’inverse, si l’insert n’est pas intégré dans le plasmide, l’antitoxine n’est pas capable d’antagoniser l’effet toxique de CcdB et les bactéries meurent.

pCR-XL-TOPO : ce vecteur et son kit de clonage sont commercialisés par INVITROGEN. Lors de la PCR, la Taq polymérase ajoute systématiquement une désoxyadénosine aux extrémités 3’ des produits d’amplification. Le vecteur pCR-XL-TOPO est un vecteur linéarisé qui contient une désoxythymidine non-appariée aux extrémités 3’. La topoisomérase I du virus de la vaccine est utilisée pour effectuer la réaction de ligation entre le vecteur et le produit PCR. Ce vecteur porte les gènes codant pour la résistance à la kanamycine. Il contient un promoteur pLac qui contrôle l’expression d’une fusion entre le

gène lacZ et le gène ccdB. L’expression de la protéine CcdB toxique est empêchée par

l’insertion du produit de PCR (dans le MCS) entre le promoteur et le gène de fusion. Ceci permet la sélection positive des recombinants après transformation. Le pCR-XL-TOPO contient le réplicon de ColEI.

IX.1.3 Oligonucléotides de synthèse

tox39-for CCCCtctagaAGGAGGgagtagtgacgaataagaaagatcac

tox39-rev CCCCctgcagttacctgaaaagctcggcgt

anti39-for atgaccgcaaatgcttatgta

anti39-rev CCTTCGCCGACTGAtcaccgtttgccagcgtcca

tox44-for CCCCtctagaAGGAGGgagtaatgatatatcaattaaagaaaacat

tox44-rev CCCCctgcagttatttcttaaaaatatcgctatg

anti44-for atgtccactgcagtattacaa

anti44-rev CCTTCGCCGACTGAtcatacttcacaatccgcaag

tox95-for CCCCtctagaAGGAGGgagtaatggactataagaaatatcagat

tox95-rev CCCCctgcagttatttgaataactttatatagtcg

anti95-for ttggtaagcgaagcaatgaca

anti95-rev CCTTCGCCGACTGAttatagtccaagttcagccct

tox133-for CCCCtctagaAGGAGGgagtaatgaaaaccagctttaagcgc

tox133-rev CCCCctgcagtcatatttctctcggatttttat

anti133-for atgatgagccataccttaact

anti133-rev CCTTCGCCGACTGAtcagttgccacggtttctct

toxi28-for CCCCtctagaAGGAGGgagtaatggcgcaagtagtctggact

tox28-rev CCCCctgcagtcacaaccgggcggcgt

tox108-for CCCCtctagaAGGAGGgagtaatgacatttcaggtttttcttgc

tox108-rev CCCCctgcagtcaatggtaatcatcctcgc

toxi110-for CCCCtctagaAGGAGGgagtaatggactataagaaatatcagatta

tox110-rev CCCCctgcagttatttgaataactttatatagtcg

En bleu : ajout de nucléotides pour permettre la restriction sur produits PCR. En vert : séquences des sites de restriction.

En rouge : Shine-Dalgarno (site de liaison du ribosome). En orange : spacer Shine-Dalgarno.

En mauve : fragment 5’ du gène ccdA.

IX.1.4 Enzymes

Restriction : XbaI et PstI (Roche). T4 DNA ligase (Roche).

Taq polymerase (Sigma).

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Phosphatase alcaline bovine (Roche). IX.1.5 Solutions • Solution d’arabinose 20% • Solution de glucose 20% • Solution de glycérol 10% • Solution de casamino-acid 20% • Stock de vitamine B1 : 1mg/ml • M9 10x

• Le TSS est composé de (pour 10ml) : 8,5ml de milieu LB, 500μl de

diméthylsulfoxide, 500μl d’une solution molaire de MgCl2, 1g de polyéthylène glycol 8000, x

ml de LB pour ajuster jusque 10ml.

• Le SDS loading buffer 1x : 50 μl de β-mercaptoéthanol, 450 μl d’eau et 500 μl de

bleu de bromophénol 2x

• Tampon de lyse : tampon Z 5ml, Polymyxine B (20mg/ml) et β-mercaptoéthanol

13,5μl.

• Solution d’orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) (4mg/ml) : 20mg

d’orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside dans 5ml de tampon Z.

•TAE 50% : 242g de tris, 57,1 ml d’acide acétique glacé et 100ml de EDTA 0,5M pH8,0.

• Solution stock d’isopropyl-β-D-galactoside (IPTG) : 1M dans de l’eau bi-distillée

stérile.

IX.1.6 Antibiotiques

Antibiotiques et concentrations des solutions stocks : • Ampicilline : 100mg/ml

• Chloramphénicole : 20mg/ml • Kanamycine : 50mg/ml