III. Matériel et méthodes

2. Protocole d’étude

2.1. Approche cytologique

2.1.1. Caryologie

2.1.1.1. Matériel et Méthodes

La numération chromosomique a eu lieu sur différents types de tissus de la plante. Si généralement ce sont les grains de pollen qui sont retenus, permettant un dénombrement plus aisé des chromosomes, grâce à un nombre n de génomes en seconde division de méiose, il n’a pas été possible de le faire sur notre matériel puisque l’on signale la présence de pieds uniquement femelles en Europe. Nous nous sommes alors dirigés vers une numération chromosomique sur des zones de forte croissance contenant de nombreuses divisions cellulaires. Nous avons ainsi choisi les méristèmes apicaux des racines.

2.1.1.2. Pré-traitement des racines

Deux protocoles différents ont été utilisés lors des campagnes de prélèvement :

Pré-traitement au 1-Bromonaphtalène :

1,5 cm d’apex racinaire sont plongés dans un tube Falcon de 50 mL contenant Une solution à 4% de 1-Bromonaphtalène pendant 3 heures.

Composition de la solution de 1-Bromonaphtalène à 4%:

- 2 mL 1-Bromonaphtalène - H2O qsp 50 mL

Pré-traitement au froid :

1,5 cm d’apex racinaire sont plongés dans de l’eau pré-refroidie à 4 °C, contenue dans un tube Falcon de 50 mL, placé immédiatement dans une enceinte isotherme remplie de la glace pilée. On laisse le tout ainsi au froid (4 °C ) et à l’obscurité pendant 12 heures.

2.1.1.3. Fixation stockage et coloration

Quelque soit le type de pré-traitement, les racines sont ensuite transférées dans une solution qui sert à la fois de fixateur, de colorant chromosomique et de stockage. Les racines sont laissées dans cette solution au minimum 1 mois.

Composition de la solution de fixation-coloration-stockage:

- 20 mL d’acide acétique glacial (100%) - 1 mL de carmin acétique

- 5 gouttes d’acétate de fer

- complété à 100 mL par de l’éthanol absolu.

Pour le protocole détaillé de la préparation du carmin acétique et de l’acétate de fer se référer à : Di Nino, 2002. On soulignera la particularité, vis-à-vis de la littérature, du temps de chauffage long pour la dissolution du carmin acétique (6 à 8 heures) et de l’utilisation d’acétate de fer dans la solution de fixation-coloration-stockage ; une particularité issue de l’expérience du laboratoire de Neuchâtel.

2.1.1.4. Dénombrement des chromosomes

Les racines sont tout d’abord placées dans une coupelle en céramique (diamètre : 5 cm) avec du carmin acétique pur (maximum 2/3 du volume de la coupelle). On y ajoute une pointe d’aiguille lancéolée d’acétate de fer. En vérifiant que les racines ne flottent pas en surface du liquide, une loupe de montre est placée sur la coupelle afin de limiter l’évaporation du liquide au cours des 3 heures de macération.

La préparation est ensuite chauffée à feu doux, toujours surmontée de la loupe de montre, et maintenue juste en dessous de l’ébullition pendant 2mn. Elle est enfin retirée du feu et refroidie immédiatement par un volume équivalent en acide acétique 45%. Après avoir laissé refroidir 5 minutes, les racines sont prêtes pour un écrasement et une observation au microscope.

Sous la loupe, la coiffe d’une racine sélectionnée est éliminée, puis une coupe d’un demi millimètre dans l’apex racinaire est effectuée à l’aide d’une lame de rasoir. Ce fragment de racine est alors déposé entre lame et lamelle pour effectuer un écrasement.

Un dessin détaillé d’une cellule présentant des chromosomes bien condensés, bien différenciés et sans chevauchement, est réalisé à l’aide d’une chambre claire. Cela permet un dénombrement exact du nombre de chromosomes.

2.1.2. Approche cytométrique

2.1.2.1. Principe de la Cytométrie de flux

Le cytomètre de flux analyse ou compte des particules, des cellules ou des noyaux cellulaires. Dans le contexte de ce travail, cet appareil est utilisé pour comparer la quantité d’ADN entre les différentes populations et les différentes espèces. Il permet ainsi de déterminer si, malgré un nombre de chromosomes identique ou différent, la quantité d’ADN reste la même ou bien varie dans les noyaux. Car deux populations de même nombre chromosomique n’ont pas forcément la même quantité d’ADN, de même que deux populations de nombres chromosomiques différents peuvent avoir la même quantité d’ADN (Di Nino, 2002).

2.1.2.2. Matériel et méthodes

Libération des noyaux cellulaires et coloration de l’ADN nucléaire

Une feuille par individu, qui doit être exempte de toute contamination algale et fongique, est lacérée avec une lame de rasoir dans 500 µL de liquide tampon (Facs Flow (optimized sheeth fluid for use on Flow cytometer instrumentation) Becton Dickinson). Ce Liquide tampon évite l’éclatement des noyaux par choc osmotique. Séparé des débris cellulaires, l’ADN nucléaire contenu dans le liquide tampon est coloré par 10 µL de Iodure de propidium, marqueur fluorescent qui se fixe spécifiquement à l’ADN et de manière proportionnelle à la quantité d’ADN présente dans le noyau.

Composition du iodure de propidium : - 50% de iodure de propidium

- 50% de solution mère de triton 10%

Composition de la solution mère de triton 10% : - 5 mL triton

- 45 mL H2O

Elle se conserve à 4 °C.

A l’aide d’une pipette, une homogénéisation du mélange par aspiration-refoulement est effectuée. Le liquide est ensuite récupéré et passé sur une membrane percée de pores d’un diamètre de 30 µm, découpée en carré de 1cm de côté et placée entre 2 embouts de pipette (cône 1 mL), et ainsi utilisée comme filtre.

Principe de l’analyse dans le cytomètre de flux Pour les détails, se référer à : Di Nino, 2002.

Les paramètres standards ont été choisis pour ce type de manipulations (LL8, en type Dot Plot, détecteurs pour le signal d’entrée : FL2 A en abscisses, FL2 H en ordonnées, analyse en sortie des données : Dot histogram, en fonction de FL2 H en abscisses).

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